Б. Подготовка постановки пцр

• Используйте стерильные материалы и только свежие перчатки (или просто чаще мойте руки), когда Вы готовите постановку ПЦР.

• Для подготовки ПЦР и матрицы для ПЦР используйте новые, ни разу неиспользованные, материалы (пластик, наконечники). Никогда не пользуйтесь мытыми и бывшими в употреблении материалами.

• Если реактивами для постановки ПЦР пользуются несколько человек, разделите исходные реактивы по аликвотам для каждого пользователя. Никогда не используйте непроверенные и чужые реактивы.

• При пипетировании старайтесь не создавать аэрозоль, которая может привести к контаминации.

• Всегда включайте в эксперимент отрицательный контроль. В качестве отрицательного контроля используйте матрицу, не содержащую гомологичной Вашим праймерам последовательности и/или так называемый “минус ДНК контроль”, где содержатся все компоненты, кроме матрицы.

Стандартная методика для проведения полимеразной цепной реакции.

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным учет результатов реакции при проведении электрофореза.

Методика проведения полимеразной цепной реакции

1. Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.

2. В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях:

Компонент	Конечная концентрация	Количество компонента на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер	1х	5 мкл
10мМ смесь дНТФ	0.2 мМ каждого	1 мкл
Праймер 1 (50 мкМ)	1 мкМ	1 мкл
Праймер 2 (50 мкМ)	1 мкМ	1 мкл
Taq-ДНК-полимераза	1.25 ед	0.5 мкл
ДНК-матрица	0.1 – 1 мкг	Варьирует от концентрации образца
Деионизированная вода	-	до 50 мкл

Комментарии к методике:

1. Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации можно опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатурации при 95°C не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНК-матрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение.

2. Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением ПЦР реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образованных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограничение по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких продуктов).

3. Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с реакционной смесью только после проведения первой денатурации.

4. Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси:

a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20°C продолжительное время, при +4°C – несколько суток;

б) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70°C и –20°C продолжительное время, при +4°C – несколько недель.

в) все, кроме матрицы. Хранить при –70°C и –20°C продолжительное время, при +4°C не более суток. Однократное замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq-полимеразы.

5. Если в методике предусмотрено использование масла, то после проведения ПЦР можно избавиться от него следующим способом:

• заморозить на –20°C. Вода замёрзнет, масло – нет;

• можно дополнительно сполоснуть охлаждённым (~4°C) хлороформом.

Оптимально проводить ПЦР в объеме реакционной смеси 50 мкл. Можно также проводить ПЦР и в меньших объемах. Для этого необходимо уменьшить в соответствующее число раз приводимые ниже количества. Минимальный рекомендуемый нами объем реакционной смеси - 10 мкл, оптимальный - 25 мкл.