Анализ результатов
Наблюдаемые на геле продукты ПЦР-реакции сопоставляется с маркером молекулярного веса для определения длины амплифицированного фрагмента (рис.6).
Рис. 6. Электрофореграмма 2%-агарозного геля. M – молекулярный маркер с известными по длине фрагментами ДНК (п.н); N – отрицательный контрольный образец (образец со всеми компонентами ПЦР-смеси, за исключением ДНК), 1,2 – образцы, в которых ПЦР-реакция не прошла; 3 – 12 – образцы с амплифицированными фрагментами ДНК.
В дорожке соответствующей отрицательному контролю никакой полосы быть не должно, в противном случае это свидетельствует о загрязнении (контаминации) реактивов ПЦР-смеси. ПЦР считается успешно прошедшей, если в дорожке видна только одна полоса на уровне соответствующей полосе маркера молекулярного веса, что свидетельствует о специфичности реакции. Если на геле не видны продукты амплификации значит в пробе присутствуют ингибиторы или нарушена методика проведения анализа, либо деградирована исходная ДНК-матрица. Возможные проблемы, встречающиеся при анализе ПЦР-реакции и способы их решения представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Возможные проблемы при постановке ПЦР и способы их решения
Проблема |
Возможная причина |
Возможные способы решения |
Шмер по дорожке с гелем |
1.Деградирует продукт
2. Неспецифичная амплификация
3. Избыток ДНК-матрицы |
1. Найдите источник загрязнения нуклеазами; убедитесь, что материал не хранился долго и повторите ПЦР; 2. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции; 3.Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы. |
Не специфические полосы по дорожке на геле
|
1. Неспецифическая амплификация
2. Избыток ДНК-матрицы |
1. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции; 2. Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы. |
Полоса продукта слабая или отсутствует |
1. Слабо покрашен гель
2. Отсутствует ДНК-матрица в пробе 3. Деградировали праймеры 4. Праймеры не отжигаются на ДНК-матрице 5. Неправильные условия проведения ПЦР 6. Вышел из строя амплификатор. |
1. Добавьте в агарозу больше бромистого этидия; 2. Добавьте ДНК-матрицу
3. Синтезируйте новые праймеры; 4. Подберите более специфичные праймеры;
5. Подберите более оптимальные условия ПЦР; 6. Замените амплификатор |