36. Методы культивирования вирусов. Способы бактериальной деконтаминации биосубстратов перед вирусологическим исследованием.

Тканевые эксплантаты или клетки, помещенные в подходящую среду, развиваются в первичные культуры с «нормальным» (диплоидным) или «ненормальным» (трансформированным или происходящим из опухоли) кариотипом.

Различают первичные культуры клеток и клеточные линии.

Первичные культуры обычно получают трипсинизацией тканей куриных эмбрионов или тканей (чаще всего почек), взятых от других видов здоровых животных

Линия клеток - первичная культура, со времени получения субкультуры клеточные линии могут иметь ограниченный срок жизни in vitro (например, диплоидные фибробласты человека и животных), а могут размножаться in vitro неограниченно долго. В последнем случае их называют постоянными, стабильными или непрерывными клеточными линиями.

Линия диплоидных клеток — клеточная линия, в которой, по крайней мере, 75% клеток обладает кариотипом нормальных клеток исходного вида.

Линия гетероплоидных клеток. Этот термин означает, что клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом.

С целью уменьшения риска эндогенного загрязнения исходного клеточного материала различными вирусами и другими патогенными возбудителями для приготовления первичных культур часто используют ткани животных, выращенные в контролируемых условиях.

37. Основные стадии репродукции вируса в клетке.

Присоединение к клеточной мембране — так называемая адсорбция. Обычно для того, чтобы вирион адсорбировался на поверхности клетки, она должна иметь в составе своей плазматической мембраны белок (часто гликопротеин) — рецептор, специфичный для данного вируса. Наличие рецептора нередко определяет круг хозяев данного вируса, а также его тканеспецифичность.

Проникновение в клетку. На следующем этапе вирусу необходимо доставить внутрь клетки свою генетическую информацию. — Рецепторно-опосредованный эндоцитоз характеризуется образованием в месте взаимодействия вириона с клеточным рецептором окаймленных пузырьков.

— Виропексис. Этим путем в клетку проникают сложноустроенные вирусы. Он заключается в слиянии мембран — вирусного суперкапсида с клеточной или ядерной мембраной (рис. 5.6). Данный процесс происходит при помощи специального бека слияния — F-белка который находится в суперкапсиде. В результате виропексиса капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид вместе с белком встра- ивается в ее плазматическую мембрану

— Фагоцитоз. Данным путем вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу

Транспорт вируса внутри клетки. Он происходит с помощью внутриклеточных мембранных пузырьков, в которых вирус переносится на рибосомы, эндоплазматическую сеть или в ядро.

«Раздевание» вириона диспротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты.

Перепрограммирование клетки. При заражении вирусом в клетке активируются специальные механизмы противовирусной защиты. Заражённые клетки начинают синтезировать сигнальные молекулы — интерфероны, переводящие окружающие здоровые клетки в противовирусное состояние и активирующие системы иммунитета. Повреждения, вызываемые размножением вируса в клетке, могут быть обнаружены системами внутреннего клеточного контроля - должен произойти апоптоз.

Персистенция. Некоторые вирусы могут переходить в латентное состояние, слабо вмешиваясь в процессы, происходящие в клетке, и активироваться лишь при определённых условиях. Так построена, например, стратегия размножения некоторых бактериофагов — до тех пор, пока заражённая клетка находится в благоприятной среде, фаг не убивает её, наследуется дочерними клетками и нередко интегрируется в клеточный геном.

Создание новых вирусных компонентов. Размножение вирусов в самом общем случае предусматривает три процесса — 1) транскрипция вирусного генома — то есть синтез вирусной мРНК, 2) её трансляция, то есть синтез вирусных белков и 3) репликация вирусного генома .

У

Созревание вирионов и выход из клетки. В конце концов, новосинтезированные геномные РНК или ДНК одеваются соответствующими белками и выходят из клетки.