Опыт 4. Влияние температуры и реакции среды на активность β-фруктофуранозидазы (сахаразы)

Цель работы: изучить влияние температуры на активность сахаразы.

Материалы и оборудование: дрожжи, 10% сахароза, 0,1 н HCl, 0,1 н NaOH, фелингова жидкость, плитка электрическая, спиртовка, термометр.

Ход работы: поместить в ступку 5 г сухих дрожжей, добавить кварцевого песка или толченого стекла, 5 мл воды и тщательно растереть. Затем добавить еще 15 мл воды, нагретой до 60ºС, и оставить на 30 мин, продолжая время от времени растирание. Слить по палочке полученную жидкость в воронку, отверстия которой закрыты фильтром, и профильтровать в колбу Бунзена при помощи водяного насоса.

Взять 7 пробирок, снабдить их этикетками и налить во все пробирки по 0,5 мл фильтрата.

Пробирка № 1: добавить 2 мл воды и поставить в холодильник.

Пробирка № 2: добавить 2 мл воды.

Пробирка № 3: добавить 2 мл воды и поставить в колбу с водой, нагретой до 40ºС.

Пробирка № 4: добавить 2 мл воды и вскипятить, тщательно прогревая стенки пробирки.

Пробирка № 5: добавить 2 мл воды и 0,1 н HCl.

Пробирка № 6: добавить 0,2 мл 0,1 н HCl и 1,8 мл воды.

Пробирка № 7: добавить 2 мл 0,1 н 0,1 н NaOH.

Затем прилить во все пробирки по 2 мл 10% раствора сахарозы и перемешать постукивая пробиркой по ладони. Пробирку № 1немедленно поместить в холодильник, пробирку № 3 – в воду с температурой 40ºС, остальные оставить в штативе. Через 15 мин прилить во все пробирки по 2 мл фелинговой жидкости и нагреть до 100ºС, погружая пробирки на 5 мин в кипящую водяную баню.

Задание: дать оценку количества образовавшегося осадка Cu₂O в баллах: 0 –нет, 1 – очень мало, 2 – мало, 3 – средне, 4 – много, 5 – очень много.

Результаты оформить в таблицу 3. При ее заполнении принять во внимание, что в пробирках № 1-4 реакция среды нейтральная (рН=7), в пробирке № 5 – сильнокислая (рН=3), № 6 – слабокислая (рН=5), № 7 – щелочная (рН=9).

Таблица 3

Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7
Температура, ºС	0	20	40	100	20	20	20
рН	7	7	7	7	3	5	9
Количество Cu2O

Сделать вывод о зависимости активности β-фруктофуранозидазы (сахаразы) от температуры и рН и вычертить соответствующие графики.

Опыт 3. Количественное определение активности дегидрогеназ

Окраска тканей разных растений тетразолием позволяет количественно оценить их дегидрогеназную активность.

Цель работы: сравнить активность дегидрогеназ в разных растениях.

Материалы и оборудование: ФЭК, стеклянные бюксы, весы торсионные, лезвия безопасной бритвы, 0,1% раствор ТТХ (трифенилтетразолий хлористый) в 0,87% растворе K₂HPO₄, 0,87% раствор K₂HPO₄, этанол, медицинский шприц, мерные цилиндры на 10 мл.

Растения: набухшие, но не проросшие семена и проростки бобов, фасоли, тыквы, спящие и прорастающие почки деревьев.

Ход работы: зародыши освобождают от семенной кожуры, с почек снимают чешуи. Берут по две навески (200-300 мг) исследуемых объектов – семядолей или почек без чешуй. Разрезают лезвием безопасной бритвы на тонкие пластинки толщиной 1-2 мм. Срезу разных объектов помещают в отдельные стеклянные бюксы. В один бюкс наливают 10 мл раствора ТТХ, в другой – 10 мл 0,87% раствора K₂HPO₄. Затем все срезы в вариантах инфильтруют этими же растворами с помощью медицинского шприца. После инфильтрации срезы переносят вновь в бюксы, закрывают крышками и помещают на 30 мин в термостат с температурой 37ºС. Срезы в бюксах с раствором ТТХ приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.

Затем срезы каждой пробы вынимают из бюкса и растирают в ступке с небольшим количеством этанола. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят этанолом до определенного объема (5-10 мл), выбранного по интенсивности окраски раствора, - чем интенсивнее окраска, тем больший можно выбрать объем. Остатки измельченных образцов должны полностью обесцветиться. После растирания пробы центрифугируют, и полученный экстракт, окрашенный формазаном, сразу колориметрируют на ФЭКе при синем светофильтре. Если в исследуемых тканях имеется хлорофилл и контрольная вытяжка окрашивается в зеленый цвет, а опытная – вместо красного в бурый, то колориметрирование проводят при зеленом светофильтре, что значительно снижает помехи, обусловленные дополнительным зеленым окрашиванием. Об активности дегидрогеназ судят по разнице в оптической плотности между величиной показаний ФЭКа в опытной и контрольной пробах. Для получения достоверных данных по активности дегидрогеназ в данном объекте исследование необходимо повторить не менее 3 раз. Величину дегидрогеназной активности в данных объектах выражают относительных единицах, исходя их разницы в величинах оптической плотности опытной (с ТТХ) и контрольной (без ТТХ) проб.

Задание: сделайте вывод об активности дегидрогеназ в разных растениях.