Определение активности пероксидазы

Растение, ярус	Навеска, г	Объем экстракта, мл	Разведение вытяжки в реакционной смеси, γ	Толщина слоя жидкости в кювете, см	Время изменения окраски раствора, с	Активность пероксидазы, изменение оптической плотности за 1 с на 1 г сырой массы

Опыт 6. Определение полифенолоксидазы.

Объекты исследования: яблоко, свежий клубень картофеля.

Ход работы: разрезать на части яблоко, клубень картофеля. Из одних половинок выжать сок в пробирки, а другие оставить на столе. Через некоторое время содержимое пробирок и поверхность срезов приобретают темно-коричневую окраску.

Задание: сделать рисунок, указав окраску объекта и время реакции. Написать объяснение реакций.

Лабораторная работа № 11.

Определение ферментных систем дыхания растений

Цель работы: провести экспериментальное определение активности основных дыхательных ферментов.

Опыт 1. Определение аскорбиновой кислоты, глутатиона и общей редуцирующей активности растительной ткани (метод Петта в модификации Прокошева)

Теоретическая часть.

Аскорбиновая кислота – неустойчивое соединение, способное к обратимому окислению и восстановлению, что обусловлено содержанием в молекуле эндиольной группы, легко окисляющейся в дикетогруппировку.

Глутатион представляет трипептид, состоящий из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и гликокола. Благодаря сульфгидрильной группе глутатион может подвергаться окислительно-восстановительным превращениям.

Аскорбиновая кислота и глутатион – сильные восстановители и могут восстанавливать S-S –связи белков, а также функционируют как промежуточные переносчики водорода при окислении некоторых органических кислот в процессе дыхания. Окислительно-восстановительные превращения аскорбиновой кислоты в растениях тесно связаны с ферментативными превращениями окисленного и восстановленного глутатиона. Содержание этих веществ в растительных тканях является показателем их восстановительной и общей физиологической активности.

Определение аскорбиновой кислоты основано на ее способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол.

2,6-дихлорфенолиндофенол дает два вида реакции. Один обусловлен изменением рН среды: в щелочной среде окраска интенсивно синяя, в кислой – бледно-красная.

Второй вид реакции – восстановительно-окислительный переход от темно-синей окраски (окисленная форма) к бесцветной (восстановленная). Эту реакцию и используют для определения аскорбиновой кислоты. Титруют до появления розового окрашивания, обусловленного избытком индикатора в кислой среде.

Определение глутатиона основано на его способности восстанавливать свободный йод, образующийся при титровании экстракта из растений йодатом калия в кислой среде.

Так как аскорбиновая кислота, как и глутатион, восстанавливают свободный йод, то титрованием устанавливают суммарную восстановительную активность растительной ткани, которую выражают в миллилитрах йодата калия. Глутатион находят, вычитая из данных титрования экстракта йодатом калия данные титрования 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

Цель работы: определить общую редуцирующую активность растительной ткани на основании содержания аскорбиновой кислоты, глутатиона.

Материалы и оборудование: различные комнатные растения или выращенные в лаборатории проростки пшеницы, овса и других сельскохозяйственных культур, 20% метафосфорная кислота, 0,001 н. йодат калия, 15% раствор йодистого калия, 1% раствор крахмала, 0,001 н 2,6-дихлорфенолиндофенола, кристаллическая аскорбиновая кислота, кварцевый песок.

Бюретки, пипетки на 10 и 1 мл, мерные колбы на 50 мл, конические колбы на 100 мл, воронки, фильтры, весы, мерные цилиндры на 25 мл.

Ход работы: 2 г листьев помещают в фарфоровую ступку, растирают с кварцевым песком и с 20 мл 5% раствора метафосфорной кислоты (HPO₃) до состояния однородной кашицы, которую переносят через воронку в мерную колбу на 50 мл, смывая ступку остатком НРО₃. Содержание колбы доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и настаивают 5 мин. Затем взбалтывают колбу 2-3 мин и фильтруют содержимое через сухой складчатый фильтр в сухую колбу.

Для определения содержания аскорбиновой кислоты в 2 бюкса берут по 5 мл фильтрата и титруют из бюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания, сохраняющегося в течение 1 мин.

Для определения количества глутатиона и общей редуцирующей активности наливают по 5 мл фильтрата в два другие бюкса, добавляют 2-3 капли 15% KJ, 5 капель 1% раствора крахмала и титруют из другой бюретки 0,001 н раствором KJO₃ до слабо-синего окрашивания, сохраняющегося 1 мин.

Расчеты проводят по следующим формулам:

Количество аскорбиновой кислоты = мг%;

Количество глутатиона = мг%;

Общая редуцирующая активность = мл,

где a – количество 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование, мл;

b – количество йодата калия, израсходованного на титрование, мл;

К – соотношение объемов: ;

0,088 – мг восстановленной аскорбиновой кислоты, эквивалентных 1 мл 0,001 н раствора краски;

0,307 – мг, восстановленного глутатиона, эквивалентных 1 мл 0,001 н раствора йодата калия;

n – навеска материала, мг;

М – общий объем экстракта, мл;

m – объем экстракта, взятого для титрования, мл.

Для приготовления раствора аскорбиновой кислоты на 2% метафосфорной кислоте в мерную колбу на 50 мл наливают 20 мл 5% НРО₃, бросают кристаллик аскорбиновой кислоты и доводят жидкость в колбе до метки дистиллированной водой. Оттитровывают 5 мл полученного раствора в двукратной повторности раствором краски и раствором йодата калия, как указано выше и рассчитывают соотношение объемов.

Результаты опытов записывают в таблицу 1.

Таблица 1

Растение	Навеска листьев, г	Объем экстракта, мл		Пошло на титрование аскорбиновой кислоты, мл		Отношение объемов	Пошло на титрование фильтрата, мл		Содержание, мг% к массе сырых листьев		Общая редуцирующая активность, м л 0,001 н KJO3 на 100 г сырых листьев
		общий	для титрования	краски	KJO3		краски	KJO3	аскорбиновой кислоты	глутатиона

Задание: провести эксперимент с различными растительными тканями одного растения (стебель, листья) и разными растениями. Сделать вывод об общей редуцирующей активности растительных тканей.