Деякі сучасні моделі автоклавів (ГК-100-2 та ін.) оснащено авто­матичною системою регуляції режиму роботи, що значно спрощує їх експлуатацію.

Стерилізація фільтруванням застосову­ється у тих випадках, коли субстрати (сироватка крові, антибіотики, вітаміни тощо) руйнуються при високій температурі. Полягає у фільтруванні рідини через спеціальні фільтри, які називають бактеріальними. Мікроорганізми затримуються на поверхні фільтрів та у їхніх порах.

Розрізняють такі різновиди бактеріальних фільтрів: керамічні (фільтрувальні свічки), азбестові та мембранні.

Керамічні фільтри (Беркефельда, Шам-берляна і т. д.) виготовляють із різних сумішей: каоліну, кварцового піску та ін. їх можна ви­користовувати багаторазово (рис. 24).

Азбестові фільтри (Зейтца) бувають різного розміру і мають різні характеристи­ки. Виготовляють їх з азбесту та целюлози. Вітчизняні фільтри бувають двох типів: Ф та СФ. Для стерилізації, як правило, використо­вують СФ.

Мембранні фільтри (колодієві мембрани) виготовляють з ацетату, целюлози, колодію та інших матеріалів. Це досить тоненькі диски різно­го діаметра. Вони можуть мати пори різної величини, що вказується у відповідному паспорті. Мембранні фільтри використовують для філь­трації різних рідин та очищення вірусів.

Стерилізацію ультрафіолетовим промінням застосовують для стерилізації приміщень (кімнати-бокси, операційні). Інколи стерилізують предмети, що руйнуються під впливом високої температури (наприклад, плексигласові пластини з лунками). Джерелом УФ-променів можуть бути бактерицидні лампи різних типів. Суттєве значення для результатів стери­лізації мають інтенсивність випромінювання лампою УФ-променів, від­стань від джерела випромінювання до поверхні предметів, експозиція.

Стерилізація ультразвуком. Ультразвук згубно діє на мікроор­ганізми. Він викликає утворення у цитоплазмі бактерій кавітаційних пухирців, наповнених парою під тиском близько 101,3 х 10⁴ кПа, що призводить до руйнування внутрішніх структур мікробної клітини.

Ультразвуком можна стерилізувати воду, молоко.

Стерилізація за допомогою хімічних речовин. Хімічні речовини найчастіше застосовують для дезінфекції приміщень, предметів, проте в мікробіологічних лабораторіях ними користуються при стерилізації. Так, з метою консервування діагностичних сироваток використовують борну кислоту, толуол, гліцерин тощо.

Іноді застосовують біологічну стерилізацію. В її основу покладе­но дію антибіотиків на мікроорганізми. Цей метод застосовують при культивуванні вірусів.

Пастеризація. Метод запропоновано Л. Пастером. Застосовується для знезаражування сільськогосподарських продуктів (молоко, м'ясні, рибні та овочеві консерви), забезпечує зберігання необхідних смакових, поживних та вітамінних якостей.

Суть методу полягає в одноразовому прогріванні продукту з наступ­ним швидким його охолодженням (до 4—8 °С). При цьому вегетативні форми бактерій гинуть, спорові - не проростають, тому пастеризацію не слід розглядати як метод стерилізації.

На практиці застосовують тривалу (30 хв. при температурі 65 °С), короткочасну (15-20 с при 73-78 °С) та миттєву (при температурі 85-90 °С без витримки) пастеризацію.

Тема 7. Культивування мікроорганізмів

Лабораторне заняття 1. Приготування живильних середовищ, знайомство з методами культивування різних груп мікроорганізмів.

Мета. Ознайомити студентів з методиками культивування різних мікроорганізмів в умовах лабораторії, навчити методикам приготу­вання живильних середовищ.

Матеріали та обладнання. Компоненти для приготування жи­вильних середовищ: агар-агар, желатин, пептон, м 'ясна вода, х. ч. МаСІ, 8—10 % розчин КОН, лійки, гігроскопічна вата, марля, градуйовані піпетки, дистильована вода, стерильні пробірки з ватяними пробками, середовища промислового виробництва (прості і складні спеціальні), рН-метр.

Культивування (вирощування) мікроорганізмів в умовах лабора­торій здійснюють з метою вивчення їх властивостей, необхідних для визначення виду (ідентифікація), одержання вакцинного матеріалу (антиген) та штамів із слабкою вірулентністю й достатньою імуноген-ністю. У спеціалізованих мікробіологічних лабораторіях культивують продуценти антибіотиків, вітамінів та інших корисних речовин.

Щоб культивувати мікроорганізми, необхідно знати умови, які б забезпечили їх ріст і розмноження: реакцію на дію атмосферного кисню, температурний оптимум, рН, потребу у поживних речовинах, вітамінах тощо; слід знати будову обладнання, що використовується у процесі культивування, зокрема конструкцію термостатів, анаеростата, рН-метрів; потрібно уміти користуватись бактеріологічною петлею і пастерівськими піпетками, володіти технікою посіву мікроорганізмів на живильні середовища і т. д.

Характеристика основних приладів, які використовують при культивуванні мікроорганізмів. Термостати - апарати, в яких під­тримується оптимальна для росту мікроорганізмів постійна температура. Існують різноманітні за конструкцією термостати. Вітчизняна промис­ловість випускає сухоповітряні та водяні (з водяною сорочкою).

Термостат має корпус, робочу камеру, електронагрівальний блок, терморегулятор. У сухоповітряному термостаті теплоізоляційним ма­теріалом є повітря, яке знаходиться між зовнішньою та внутрішньою стінками корпусу, у водяних - вода.

У нижній частині корпусу вмонтовано електронагрівник. Вмикання його в електромережу та вимикання з неї здійснюється автоматично, за допомогою терморегулятора. Конструкція останнього може бути різною. До цього часу широко використовували так звані "біметалеві терморегулятори", нині - контактні термометри.

Сучасні термостати автоматизовані, мають панель з високою інформа­цією: покажчик температури у робочій камері, покажчик температурного режиму, заданого на терморегуляторі, і т. д.

Термостат встановлюють відповідно до паспортних даних, обов'язково заземлюють. Робоча камера термостата повинна бути чистою і сухою.

Термостат відкривають лише на період розміщення в робочій камері необхідних матеріалів чи при потребі їх забрати.

Анаеростат - металевий, циліндричної форми апарат з герметич­ною кришкою, обладнаний вакуум-манометром та кранами, через які при необхідності всередину подають С0₂та інші гази. Анаеростат при­значений для вирощування анаеробів та мікроаерофілів (рис. 25).

Посіви мікроорганізмів (у пробірках, бактеріологічних чашках тощо) розміщують у камері анаеростата, закривають покришкою і насосом із робочої камери відкачують повітря. Ступінь розрідження останнього визначають за допомогою вмонтованого манометра. Коли покажчик вакууму досягне необхідної величини, загвинчують кран, насос вимикають і анаеростат ставлять у термостат.

Живильні середовища. Мікроорганізми культивують на живиль¬них середовищах. Останні розрізняють за походженням - природні й штучні, за консистенцією - рідкі, тверді, напівтверді, за призначен¬ням - звичайні (прості та універсальні) і спеціальні.

Характеристика основних живильних середовищ

До звичайних середовищ належать м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), м'ясо-пептонний агар (МПА) та ін. Звичайними середовища називають тому, що на них можна вирощувати більшість мікроорганізмів. Жодна мікробіологічна лабораторія, у т. ч. й ветеринарна, не обходиться без МПА, МПБ.

Основою для приготування звичайних живильних середовищ є м'ясна вода. Приготування останньої включає такі етапи. Беруть яло­вичину чи конину. Видаляють кістки, сухожилля, фасції, жир. М'ясо подрібнюють на м'ясорубці, зважують і заливають подвійною кількістю водопровідної води. Залишають у прохолодному місці на 13-24 години. Фарш віджимають, а м'ясний екстракт кип'ятять на слабкому вогні протягом 1,5-2 години, фільтрують (спочатку через ватно-марлевий, потім - через паперовий фільтри), доводять до попереднього об'єму водопровідною водою, розливають у колби й стерилізують ЗО хв. при температурі 120 °С. Зберігають у сухому, темному прохолодному місці і використовують у міру потреби.

Приготування м'ясо-пептонпого бульйону (МПБ). До м'ясної води додають 1 % пептону (продукт неповного гідролізу білка, який виготовляють на м'ясокомбінатах з дешевої сировини), 0,5 % хлори­ду натрію і кип'ятять, постійно помішуючи, до повного розчинення пептону. Визначають рН колориметричним методом чи за допомогою потенціометра. Оскільки м'ясна вода має слабокислс середовище, МПБ, виготовлений з неї, також слабокислий. Для нормалізації рН вносять 10-15 % розчин КОН або ИаОН, кип'ятять 2-3 хв. і знову визначають рН. Реакція МПБ повинна бути лужною (рН 7,3-7,6).

Залежно від потреби МПБ розливають у колби чи пробірки (в остан­ні - по 5-8 мл), закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують в автоклаві.

Приготування м 'ясо-пептонного агару (МПА). До МПБ додають 2-3 % подрібненого і замоченого у холодній воді агар-агару (безазотиста речовина, яку одержують із морських водоростей; забезпечує твердість середовища), кип'ятять до повного розчинення агар-агару, визначають рН. При необхідності додають розчин КОН або NaОН, гарячим фільтрують через ватно-марлевий фільтр. Розливають у колби чи пробірки й стери­лізують в автоклаві (20-30 хв. при 1,01 х 10⁵ Па). Зберігають у сухому, прохолодному місці. Перед використанням розплавляють при температурі 100 °С (у водяній бані), при необхідності розливають у стерильні пробірки, дотримуючи умов стерильності. Іноді розплавлений агар розливають у стерильні бактеріологічні чашки (по 8-10 мл) і залишають на 15-20 хв. при кімнатній температурі МПА затвердне при температурі 35-40 °С.

МПА у пробірках найчастіше використовують у вигляді "кося­ків", що значно збільшує поверх­ню середовища для вирощування мікроорганізмів. Для цього пробір­ки з розплавленим агаром кладуть під кутом 5-6 °С і тримають доти, поки агар не затвердіє (рис. 26).

Спеціальні живильні середо­вища. Залежно від призначення спеціальні живильні середовища поділяють на: середовища для ви­рощування певних мікроорганізмів (Петраньяні - для збудника тубер­кульозу); середовища для диференціації окремих груп мікроорганізмів (Ендо - для диференціації сальмонел і кишкових паличок); середовища для визначення біохімічних та інших властивостей у бактерій (Пса- для визначення цукролітичних властивостей). До спеціальних живильних середовищ належать також селективні живильні середовища, призна­чені для виділення певного виду бактерій з матеріалів, які мають інші мікроорганізми. Ця група включає збагачувальні (середовища нагрома­дження, призначені для попереднього збільшення концентрації бактерій у процесі виділення їх із досліджуваних матеріалів).

Приготування окремих спеціальних живильних середовищ. Сироватковий МПБ і сироватковий МПА. До розплавленого, а потім остудженого до 50-45 °С МПА додають 5-10 % стерильної сироватки крові коня (вівці, кролика), ретельно змішують, струшуючи колбу, роз­ливають у бактеріологічні чашки чи пробірки й залишають на 20-30 хв. при кімнатній температурі для затвердіння МПА.

Щоб одержати сироватковий МПБ, до звичайного МПБ у стериль­них умовах додають кров'яну сироватку у такій же кількості, як і для приготування сироваткового МПА.

Кров'яний МПА готують так, як і сироватковий, проте замість си­роватки вносять 5-10 % дефібринованої крові.

Цукровий МПБ і цукровий МПА. До МПБ чи МПА (розплавленого) додають 1-2 % глюкози, ретельно змішують і стерилізують проточною парою або у автоклаві при 0,505-10⁵ Па (0,5 атм протягом 20 хвилин).

М'ясо-пептонна желатина (МПЖ). До МПБ додають 10-20 % желатини, варять до повного її розчинення, визначають рН, фільтру­ють через ватно-марлевий фільтр, розливають у стерильні пробірки й стерилізують проточною парою.

Середовище Ендо. До 100 мл МПА додають 1 мл 10 % водного розчину кристалічного вуглекислого натрію й нагрівають протя­гом 10 хв. при температурі 100 °С (водяна баня або апарат Коха). Охолоджують до 60 °С, вносять 1 г хімічно чистої лактози та суміш фуксину з безводним сульфітом натрію. Для приготування цієї сумі­ші 0,5 г сульфіту натрію розчиняють у 5 мл стерильної води. До 1 мл насиченого спиртового розчину основного кристалічного фуксину додають свіжоприготовлений розчин сульфіту, доки рідина не знебар­виться або не зробиться злегка рожевою. При внесенні знебарвленої суміші фуксину з сульфітом розплавлений агар набуває червонуватого кольору. Після ретельного перемішування середовище розливають у бактеріологічні чашки. Середовище готують перед посівом, його рН повинен становити 7,5.

Сучасна промисловість виробляє багато середовищ і постачає у лабораторії. Використання їх значно полегшує процес культивування мікроорганізмів.

Незалежно від характеру живильні середовища повинні відповідати загальним вимогам: бути стерильними, мати оптимальний показник рН (у більшості випадків 7,3-7,4) й осмотичного тиску, містити необхідні поживні речовини (джерела азотистого, вуглецевого живлення, міне­ральні елементи тощо), достатню кількість води.

Прилади для визначення рН живильних середовищ. рН живиль­ного середовища (співвідношення іонів Н та ОН) має велике значення для росту і розмноження мікроорганізмів. Для визначення його засто­совують колориметричний метод або спеціальний прилад (рН-метр).

Визначення рН колориметричним методом. В основу методу по­кладено зміну кольору індикатора залежно від наявності у розчині Н⁺- та ОН-іонів. Іони Н+ зумовлюють кислу, ОН- - лужну реакцію. Нейтральна реакція (рН 7,2) свідчить про те, що кількість Н+- і ОН-іонів однакова.

Як індикатори використовують мета-нітрофенол, пара-нітрофенол, гамма-нітрофенол та альфанітрофенол.

Кислотність визначають за допомогою приладів - макро- та мікро-Міхаеліса, обладнаних компаратором Уолпола, набором згаданих вище індикаторів та шкали стандартів рН.

Методику визначення рН згаданим методом викладено у відповід­них інструкціях.

рН-метри досить широко використовують у лабораторіях для визначення рН розчинів та живильних середовищ. Промисловість випускає кілька моделей цих приладів. Найбільш поширені рН-метри типу ЛПУ-01.

У сучасних приладах для визначення рН використовується електро­дна система зі скляним електродом, електрорушійна сила (ЕРС) якого залежить від активності іонів водню у розчині.

Скляний електрод - це трубка з напаяною на конус порожньою куль­кою з літієвого скла. Якщо електрод занурити у розчин, між поверхнею кульки і розчином відбувається обмін іонами, в результаті чого іони літію у поверхневих шарах скла заміщуються іонами водню, і скляний електрод набуває властивостей водневого електрода.

Між поверхнею скла і досліджуваним розчином виникає різниця потенціалів Е_х, величина якої визначається активністю водню у роз­чині. Для того, щоб створити електричний ланцюг при визначенні рН, використовують контактні електроди: внутрішній контактний, що за­безпечує електричний контакт з розчином, яким наповнено внутрішню частину скляного електроду, та зовнішній контактний (допоміжний), який забезпечує електричний контакт з досліджуваним розчином.

Щоб захистити від дії високої температури (при визначенні рН га­рячих розчинів), допоміжний електрод залишають поза досліджуваним розчином і з'єднують його з трубкою, наповненою насиченим розчином хлориду калію. Закінчується трубка пористою перетинкою. Розчин хлориду калію постійно просочується крізь пористу перетинку, чим запобігає проникненню з досліджуваного розчину у систему електро­да побічних іонів, які б могли змінити величину ЕРС електрода. ЕРС електродної системи залежить від рН розчину.

Вимірюючи ЕРС електродної системи за допомогою електронного мікровольтметра, шкала якого градуйована в одиницях рН, визначають рН досліджуваного розчину.

Лабораторне заняття 2. Техніка посіву мікроорганізмів на

живильні середовища, виділення чистих культур.

Мета: навчити студентів техніці посіву на живильні середовища, методикам виділення чистої культури.

Матеріали та обладнання. Живильні середовища у пробірках та чашках Петрі (МПБ, МПА, МПЖ), суспензія мікроорганізмів-сапрофі-тів (у пробірках), змішана мікробна культура (стафілокок-сапрофіт та непатогенна кишкова паличка), бактеріологічні петлі, пастерівські піпетки, скляні шпателі, спиртівки.

У мікробіології відпрацьовано систему маніпуляцій (мікробіологіч­на техніка, бактеріологічна техніка), яка дає змогу здійснювати посіви, пересіви мікроорганізмів без їх "забруднення", запобігає контамінації ними зовнішнього середовища.

Техніка посіву буває різною, проте незалежно від її модифікації слід завжди дотримувати загальних правил. Перш за все посів роблять біля факела горілки (спиртівки), попередньо ретельно стерилізуючи бактеріологічну петлю, обробляючи краї пробірок (під час їх відкривання та закривання), пробки. Пробірки утримують майже горизонтально, не змочуючи при цьому пробок. Бактеріологічні чашки відкривають трохи, лише для здійснення посіву.

Посів патологічного матеріалу або мікробної культури здійснюють за допо­могою бактеріологічної (мікробіологіч­ної) петлі, голки чи пастерівської піпетки. Інколи використовують шпателі (рис. 27). Бактеріологічну петлю, голку стерилізу­ють фламбуванням під час посіву, пас­терівську піпетку та шпатель - завчасно в автоклаві.

Посів мікроорганізмів на тверде живильне середовище. Посів на косий агар у пробірці. Пробірки з посівним матеріалом та скошеним агаром беруть у ліву руку так, щоб скошена поверхня агару була зверху. Тримаючи у правій руці бактеріологічну петлю, ретельно її фламбують. Потім мізинцем правоїруки відкривають пробірку (пробку утримують мізинцем), знезаражують полум'ям її краї, простерилізованою петлею беруть посівний матеріал і переносять у пробірку із стерильним жи­вильним середовищем. Матеріал, легенько рухаючи петлею, вносять у конденсаційну рідину, суспензують його і плавним рухом (краще зигзагоподібним) висівають по всій поверхні. Петлю виймають, краї пробірки знезаражують полум'ям горілки і закривають пробкою. Петлю стерилізують фламбуванням.

Посів на МЛА у бактеріологічній чашці. Бактеріологічну чашку кла­дуть біля горілки, фіксують лівою рукою. Покришку піднімають великим, середнім та вказівним пальцями настільки, щоб у щілину можна було ввес­ти бактеріологічну петлю, пастерівську піпетку, а при потребі і шпатель.

Маніпулюють в основному таким же чином, як і при посіві ма­теріалу на скошений МПА. Якщо сіють бактеріологічною петлею, то матеріал злегка занурюють у живильне середовище і розтирають на стінці пробірки. При використанні пастерівської піпетки кінець її за­нурюють у живильне середовище, а матеріші видувають. Використані пастерівські піпетки знезаражують у дезрозчині.

Посів уколом у стовпчик живильного середовища. Пробірку з живильним середовищем беруть у ліву руку, мізинцем правої руки знімають пробку і перевертають пробірку догори. Петлю або голку з до­сліджуваним матеріалом по центру живильного середовища занурюють до самого дна пробірки й потім виймають. Пробірку закривають, петлю стерилізують. Засіяні пробірки та чашки підписують (№ експертизи, дата) і поміщають у термостат для вирощування.

Особливості культивування анаеробів. Анаеробні мікроорганізми вирощують на спеціальних живильних середовищах або створюють для них анаеробні умови іншим способом.

Вирощування анаеробів на середовищі Кітт—Тароцці. Середовище Кітт-Тароцці-м'ясо-пептонний печінковий бульйон (див. додаток). Перед посівом середовище регенерують. Для цього пробірки з ним кип'ятять у водяній бані, потім швидко охолоджують під струменем холодної води.

При кип'ятінні зв'язаний із середовищем кисень виділяється, а вазе­лінове масло, яке знаходиться на його поверхні, запобігає проникненню кисню в середовище.

Посів здійснюють бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Матеріал вносять через шар масла у бульйон так, щоб не до­пустити проникнення в нього повітря.

Методи створення анаеробних умов. Анаеробіоз створюють фізич­ним, хімічним та біологічним методами.

Фізичний метод. За допомогою вакуумного насоса відкачують по­вітря з анаеростата чи спеціального ексикатора.

Хімічний метод. На дно ексикатора (звичайний, який у покришці немає отвору) ставлять бактеріологічну чашку з хімічними речовинами, які, взаємодіючи між собою, поглинають кисень (наприклад, 10 % роз­чин пірогалолу і їдкий натр або суміш гідросульфіту натрію та вугле­кислої соди). Пробірки або бактеріологічні чашки, засіяні анаеробами, поміщають на стандартну фарфорову підставку і щільно закривають покришкою, краї якої попередньо обробляють вазеліновим маслом. Після цього ексикатор ставлять у термостат.

Біологічний метод. Беруть бактеріологічну чашку з твердим жи­вильним середовищем. Дотримуючи умов стерильності, по діаметру вирізають і видаляють вузеньку смужку живильного середовища. Таким чином одержують дві, ізольовані одна від іншої, частини серед­овища. На поверхню однієї висівають анаероби, другої-аероби. Чашку накривають покришкою. Стерильною ватою закривають щілину й за­клеюють пластирем або запарафінованою смужкою паперу. Після цього чашки ставлять у термостат. Спочатку ростуть аероби. Вони використо­вують кисень і створюють необхідні умови для росту анаеробів.

Пробірки ставлять у штативи, бактеріологічні чашки кладуть на полиці термостата кришкою донизу.

Методика отримання (виділення) чистої культури. Вирощені на живильних середовищах мікроорганізми називають мікробною куль­турою. Вона може бути чистою, якщо ростуть мікроорганізми одного виду, і змішаною, якщо росте два і більше видів.

Матеріали, які надсилають у лабораторію для бактеріологічного дослідження, досить часто містять кілька видів мікроорганізмів. Для того, щоб їх вивчити (перш за все з метою визначення виду), спочатку необхідно одержати чисту культуру.

Є кілька методів одержання чистої культури. Найбільш поширені метод розведень. Дригальського та біологічний.

• Метод розведень запропоновано Пастером, пізніше - модифіковано. Беруть 7-10 пробірок зі стерильним ізотонічним розчином хлориду на­трію або МПБ (по 9-10 мл). У першу пробірку вносять невелику кіль­кість досліджуваного матеріалу (0,1 мл), перемішують. Таку ж кількість вмісту першої пробірки переносять у другу, а після перемішування — у третю, четверту і т. д.

Із збільшенням кількості розведень концентрація мікроорганізмів знижується, що забезпечує ріст ізольованих колоній. Для цього з кіль­кох пробірок (як правило, останніх) роблять посів на тверде живильне середовище у бактеріологічних чашках. Після інкубації у термостаті утворені колонії вивчають і роблять відсіви з ізольованих колоній на стерильне живильне середовище. На останньому мікроорганізми рос­туть у вигляді чистої культури.

• Суть методу Дригальського - одержання на першому етапі ізольо­ваних колоній. Беруть кілька (3-5) бактеріологічних чашок з МПА або іншим середовищем \У першу вносять краплю досліджуваного матері­алу. Стерильним шпателем рівномірно розподіляють його по поверхні середовища, а потім, не фламбуючи, шпатель відразу переносять у другу чашку, і матеріал, що залишився на шпателі, розподіляють по поверхні середовища. Це ж саме роблять з третьою, четвертою і п'ятою чашками. Після цього чашки ставлять у термостат і, якщо виростуть ізольовані колонії, з них роблять відсів на стерильне живильне середовище.

Існують інші методи отримання чистих культур. Вони основані на такому ж принципі - одержання ізольованих колоній: посів штрихами, посів по секторах у бактеріологічні чашки.

Біологічний метод виділення чистої культури застосовують для одержання чистої культури патогенних видів. Досліджуваний матеріал уводять тварині, сприйнятливій до певного захворювання. Мікроорганізми, швидко розмножуючись, викликають захворювання і смерть тварини. Із крові або внутрішніх органів, інколи - мозку, роблять посіви і, як правило, одержують чисту культуру.

Бацили (клостридії) від бактерій, що не утворюють спор, відділя­ють шляхом одноразового прогрівання матеріалу на водяній бані при температурі 80 °С протягом 30-40 хвилин. Вегетативні форми мікро­організмів гинуть, а спори залишаються.

Одержання чистої культури рухливих видів. Методика розробле­на Шукевичем (посів по Шукевичу). Посів досліджуваного матеріалу здійснюють лише у конденсаційну рідину скошеного МПА у пробірці. Пробірки ставлять у термостат. Рухливі бактерії порівняно з нерухли­вими на поверхні агару ростуть швидше. З верхнього краю культури, яка виросла, легеньким доторканням бактеріологічною петлею беруть мікробну масу й засівають її на стерильне живильне середовище.

Лабораторне заняття 3. Культуральні властивості мікро­організмів.

Мета. Ознайомити студентів з методикою описання культурапь-них властивостей у різних мікроорганізмів.

Матеріали та обладнання. Мікробні культури, вирощені на рідких та щільних живильних середовищах, мікроскоп стереоско­пічний, лупи.

Під культуральними властивостями мікроорганізмів розуміють характеристику їх росту на живильних середовищах.

Ознаки росту бактерій часто використовують у процесі їх ідентифі­кації. У зв'язку з тим, що ознаки росту мікроорганізмів з часом можуть змінюватись, прийнято характеризувати їх у 16-18- та 24—28-годинних культурах.

Ріст мікроорганізмів на рідких живильних середовищах. Основні ознаки мікробної культури у бульйоні - це помутніння середовища, поверхневий ріст та осад.

Ступінь помутніння може бути різним: інтенсивним, помірним, слабким, у вигляді опалесценції. Деякі види бактерій помутніння не викликають.

Поверхневий ріст буває у вигляді плівки і кільця при стінці (осад). Розрізняють тоненьку, грубу, сітчасту, білу, сіру, жовтувату, складчасту, пухнасту, крихку, слизьку плівки.

Осад може бути значним, незначним, зернистим, пилоподібним, у вигляді шматочків вати, пластівців, за кольором - сіруватий, білий, жовтий, зеленуватий. При струшуванні він може набувати вигляду рів­номірного помутніння або утворює пластівці (маленькі, великі), крихти. Слизоподібний осад піднімається угору у вигляді "косички".

У різних видів бактерій ознаки росту можуть бути неоднаковими.

Ріст мікроорганізмів на твердих живильних середовищах (МПА). На твердих живильних середовищах мікроорганізми утворюють колонії. Останні у бактерій різних видів різняться між собою (рис. 28). Вивчають їх неозброєним оком, а також за допомогою лупи чи під мікроскопом (об'єктив 8 х). Спочатку відмічають характер росту. Він може бути пишним, помірним та бідним. Потім вивчають окремі колонії.

При цьому звертають увагу на:

- розмір колоній. Вони бу­вають середніми (3-4 мм), дрібними (1—2 мм), великими (діаметр перебільшує 4 мм) і мізерними (колонії-росинки діаметром менше 1 мм);

- форму (округла, овальна, зір­коподібна, коренеподібна);

- краї (рівні, хвилясті, зубчас­ті, кучероподібні);

- поверхню (гладенька, блис­куча, горбиста, борошниста, зморшкувата, складчаста);

- рельєф (профіль - плоский, опуклий, кратеропо-дібний, фігурний; рис. 29);

- прозорість (прозорі, непрозорі, каламутні, флу­оресціюючі) ;

- колір (сірувато-білий, білий, оранжевий, голубий, золотистий, зелений, червоний та ін.; зустрічають­ся також безбарвні колонії);

- консистенцію (тверда, крихка, слизувата, тісто­подібна, масляниста);

- структуру (однорідна, волокниста, плівчаста, зерниста).

Колонії, що мають рівні краї та гладку поверх­ню, відносять до Б-форми, а колонії з нерівними краями і шорсткою поверхнею - до Я-форми.

Характеристика росту мікроорганізмів на напіврідкому м'ясо-пептонному агарі та МПЖ. ііри посіві методом уколу більшість мікроорганізмів утворюють білу­ватий стержень. Рухливі зумовлюють помутніння середовища різної інтенсивності у вигляді хмаринок. Аероби ростуть ближче до поверхні середовища, анаероби - на дні, факультативні анаероби - по всій товщі стовпчика. Мікроорганізми, які мають протеолітичні ферменти, роз­ріджують желатину. Інтенсивність та форми розрідження можуть бути різними, що залежить від виду мікроорганізмів та інших факторів.

Лабораторне заняття 4. Вивчення ферментативних власти­востей мікроорганізмів.

Мета. Ознайомити студентів з методиками визначення фермен­тативних властивостей у мікроорганізмів.

Обладнання та реактиви. Мікроскопи, набори середовищ та реактивів для визначення цукролітичних, протеолітичних таредукуючих властивос­тей мікроргінізмів. Мікробні культури (кишковоїпалички, сальмонели та ін.), актеріологічні петлі, пастерівські піпетки, спиртівки (газові горілки).

Мікроби певного виду продукують ферменти, набір яких в опти­мальних умовах вирощування стабільний. Останнє і дає змогу викорис­тати результати вивчення ферментативних (біохімічних) властивостей мікроорганізмів з метою визначення їх видової належності.

Біохімічна активність мікроорганізмів різноманітна. Ферменти бе­руть участь у всіх реакціях, що забезпечують існування та розмноження мікроорганізмів: живлення, дихання, рух тощо.

У мікробіологічних лабораторіях визначають цукролітичні, про­теолітичні та редукуючі властивості мікроорганізмів.

Визначення цукролітичних властивостей. Цукролітичні власти­вості - це здатність мікроорганізмів ферментувати цукри (вуглеводи та багатоатомні спирти), їх визначають за допомогою спеціальних середо­вищ, зокрема середовища Гіса. Останнє готують на основі пептонної води, цукру (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маніт, дульцит, сорбіт та ін.) й індикатора Андреде.

Набір середовищ з вуглеводами разом із деякими середовищами, призначений для вивчення протеолітичних та редукуючих властивостей, називають строкатим рядом.

Середовище Гіса буває рідким та напівтвердим. У останньому ви­падку воно містить 0,25-0,30 % агар-агару.

Для визначення цукролітичних властивостей бульйонну чи агарову культуру досліджуваного мікроорганізму висівають на середовище Гіса з різними цукрами. Результати враховують після 18-24-годинного інкубу­вання в умовах термостата. Якщо мікроорганізм не ферментує цукру, який входить до складу середовища Гіса, то останнє не змінює свого кольору. Якщо колір середовища змінюється (у червоний при індикаторі Андреде), це означає, що цукор розкладається з утворенням кислоти. Якщо при цьому утворюється й газ, його спостерігають у поплавку (витісняє середо­вище) або у вигляді бульбашок у товщі напівтвердого середовища.

З метою визначення цукролітичних властивостей мікроорганіз­мів інколи застосовують тверді середовища. Наприклад, агар Ендо, Плоскірєва, Левіна та ін.

Останнім часом у практику лабораторій впроваджено систему ін­дикаторного паперу (СІП). Це - диски чи смужки хроматографічного паперу, просочені певним субстратом (глюкоза, маніт тощо) та відповід­ним індикатором. СІП рекомендують використовувати для диференціації мікроорганізмів сімейства ентеробактерій.

Визначення ферментативних властивостей бактерій щодо вуг­леводів та багатоатомних спиртів. У пробірці з 0,3 мл стерильного 0,85 % розчину натрію хлориду (рН 7,3+0) суспензують повну петлю добової агарової культури й занурюють диск, просочений відповідним вуглеводом чи багатоатомним спиртом та індикатором. Позитивний результат характеризується тим, що вміст пробірки набуває червоного кольору.

Для визначення газоутворення у пробірку кладуть маленькі шматоч­ки стерильної гігроскопічної вати і ставлять у термостат на 5-18 годин. Газ у вигляді маленьких кульок осідає на шматочку вати.

Визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів. Протеолітичними властивостями вважають здатність мікроорганізмів ферментувати білки. Для їх визначення досліджувану культуру висіва­ють на МПЖ, молоко. Ступінь протеолізу білка визначають за наявністю індолу, сірководню та ін.

Посів на МПЖ здійснюють уколом за допомогою бактеріологічної голки. Інкубують при температурі 20-22 °С або у термостаті, що зале­жить від здатності досліджуваного мікроорганізму розмножуватись при кімнатній температурі. Якщо інкубацію здійснювали у термостаті (38 °С), перед оцінкою результату пробірки охолоджують під струменем води.

Про наявність протеолітичного ферменту свідчить розрідження желатини. Воно може відрізнятись як за інтенсивністю, так і за формою, що залежить перш за все від виду мікроорганізму.

При посіві на молоко протеоліз характеризується розпушуванням згустка казеїну, молоко стає прозорим.

Розщеплення білків частіше супроводжується виділенням індолу, сірководню, деяких інших газів, наявність яких свідчить про протеолі­тичну активність мікробних культур.

Є кілька методів визначення індолу. Найчастіше застосовують метод індикаторного паперу (МШ).

Фільтрувальний папір просочують гарячим насиченим водним 12 % розчином щавлевої кислоти, висушують на повітрі і нарізають смужка­ми (10 х 0,5 см). Зберігають у скляних банках з притертими пробками. Щоб виявити наявність індолу, досліджувану культуру висівають на МПБ у пробірку, вставляють індикаторний папір так, щоб нижній його кінець не доторкався до поверхні середовища. Верхній кінець паперу закріплюють ватною пробкою. Інкубують 24—72 години в умовах термо­стата. Порожевіння нижнього кінця паперу свідчить про те, що протеоліз супроводжується утворенням індолу.

Інколи вміст індолу визначають за допомогою реактиву Ерліха (пара-диметиламідобензальдегід - 1г, спирт етиловий 96 %- 100 мл, со ляна кислота кваліфікації "х.ч." - 20 мл). Досліджуваний мікроорганізм висівають на МПБ й інкубують протягом 48-72 годин. Потім вносять (до 5 мл бульйонної культури) 2 мл ефіру. Вміст змішують струшуванням пробірки й відстоюють. Коли ефір утворить на поверхні суцільний шар, під нього пастерівською піпеткою вносять 0,5-1 мл реактиву Ерліха. При наявності індолу на межі між ефіром та бульйонною культурою протягом 3-5 хв. утвориться рожеве або червоне кільце.

Визначення сірководню. Існує метод індикаторного паперу. Різниця полягає у тому, що його просочують не щавлевою кислотою, а 10% розчином оцтовокислого свинцю. При наявності сірководню нижній кінець паперу чорніє (утворюється РЬБ).

Наявність сірководню можна визначити також за допомогою спе­ціального середовища такого складу: до стерильного 1,7-2 % МПА до­дають 0,2 % сірчанокислого заліза, 0,3 гіпосульфіту натрію, 1 г глюкози, 12 мл 0,3 % водного розчину фенолроту. Середовище розливають у стерильні пробірки (по 5-6 мл), стерилізують проточною парою 20 хви­лин. Перед використанням його розплавляють і в пробірках готують косяки. Висівають спочатку на поверхню агару, потім - уколом у нижню частину стовпчика. При наявності сірководню середовище червоніє, а нижня його частина чорніє.

Визначення редукуючих властивостей. Методи основані на зміні кольору органічних фарб (малахітовий зелений, метиленовий синій, нейтральний червоний тощо) під дією мікробного ферменту редуктази. Фарби вносять у живильне середовище.

Середовище Омелянського. До 100 мл МПА (рН 7,4-7,6) додають 10 крапель 10% розчину метиленового синього. Досліджувану культуру висівають. Інкубують у термостаті протягом 24 годин. При рості мікро­організмів, які утворюють редуктазу, середовище знебарвлюється.

Молоко з метиленовим синім. До 100 мл знежиреного молока (рН 7,1) додають 2 мл 1 % водного розчину метиленового синього. Розливають (по 5 мл) у пробірки й стерилізують проточною парою три дні підряд по ЗО хвилин. Середовище має голубий колір. Досліджуваний мікроорганізм висівають і інкубують у термостаті протягом 24 годин. При наявності редуктази молоко знебарвлюється.

Визначення каталази. Є кілька методів, основаних на застосуванні перекису водню (Н₂0₂).

Культуру досліджуваного мікроорганізму вирощують на МПБ. До 1 мл добової культури додають 1 мл 10 % розчину перекису водню. При наявності каталази утворюються пухирці газу.