Количественное определение мочевины и аммиака в биологических жидкостях

Задание 1. Определить содержание мочевины в сыворотке крови.

Принцип. Мочевина в присутствии тиосемикарбазида и солей феррума в сильно кислой среде способна образовывать с диацетилмонооксимом соединение розово-красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины.

Ход работы. Определение проводится в пробирках, которые заполняют в соответствии со схемой.

	Опытная проба	Калибровочная проба	Холостая проба
Сыворотка крови (мл)	0,01
Калибровочный (эталонный) раствор мочевины (16,65 ммоль/л) (мл)		0,01
Дистиллированная вода (мл)			0,01
Рабочий раствор для цветной реакции (диацетилмонооксим, тиосемикарбазид, хлорное железо, сульфатная кислота) (мл)	2,0	2,0	2,0

Пробирки закрывают крышечками из алюминиевой фольги и нагревают точно 10 мин в кипящий водяной бане; охлаждают 2-3 мин в струе холодной воды и на протяжении 15 мин фотометрируют в 1 см кювете при длине волны 490-540 нм. Содержание мочевины (Х) в ммоль/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле: Х = (Е_оп.×16,65)/ Е_ст., где Е_оп.- экстинкция опытной пробы; 16,65 – концентрация мочевины в стандартной пробе (ммоль/л); Е_ст. - экстинкция стандартной пробы.

Задание 2. Определить содержание мочевины в моче.

Принцип. Тот же.

Ход работы. Для анализа используют 0,1 мл собранной в течение суток, профильтрованной и разбавленной в 25 раз мочи и 0,1 мл стандартного раствора мочевины. Обрабатывают пробы так же, как и сыворотку крови. Содержание мочевины (У) в ммоль/сут в моче рассчитывают по формуле:

У=(Е_оп.×V×25×1,665)/(Е_ст.×0,1×1000), где Е_оп.- экстинкция опытной пробы; V – объём суточной мочи; 1,665 – концентрация мочевины в 0,1 мл стандартной пробы (мкмоль); 0,1 – объём мочи, взятый для исследования (мл); Е_ст. - экстинкция стандартной пробы; 1000 - коэффициент перерасчета мкмоль в ммоль; 25 - разведение.

Задание 3. Определить содержание мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с помощью «Уреатеста».

Принцип. Метод базируется на способности уреазы расщеплять мочевину с образованием аммиака, который окрашивает полоску реактивной хроматографической бумаги в голубой цвет. Высота окрашенной зоны пропорциональна концентрации мочевины, которую рассчитывают по калибровочному графику.

Ход работы. Сыворотку крови разводят водой в соотношении 1:1. На насыщенный уреазой конец бумажной полоски в 3 мм от красной парафиновой полоски наносят с помощью специальной пипетки 0,03 мл разбавленной сыворотки крови. Полоску немедленно помещают в чистую сухую пробирку, герметически закрывают её пробкой и ставят в термостат при 37°С. Через 20 мин полоску удаляют, измеряют высоту зоны, которая окрашивается в голубой цвет. По калибровочной шкале, входящей в набор «Уреатест», находят концентрацию мочевины в сыворотке крови.

Задание 4. Определить содержание аммиака в моче.

Принцип. Метод базируется на взаимодействии солей аммония с формальдегидом, в результате чего образуется гексаметилентетрамин (уротропин) и высвобождается эквивалентное количеству аммиака количество кислоты, которую оттитровывают раствором основания:

4NH₄Cl+6СН₂О → N₄(CH₂)₆ + 4HCl + 6H₂O.

Ход работы. В колбу наливают 10 мл мочи, прибавляют 1-2 капли фенолфталеина и нейтрализуют 0,1 М раствором натрия гидроксида. Прибавляют равный объём свеженейтрализованного раствора формальдегида. Вследствие выделения кислоты розовая окраска исчезает. Смесь титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления розовой окраски. По объёму основания, израсходованного на титрование, рассчитывают содержание аммиака (Z) в г в суточной моче по формуле: Z = (а×0,0017×D)/10, где а - объём основания, израсходованного на титрование, мл; 0,0017 - количество аммиака, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида (титр аммиака) (г); D - суточное количество мочи (мл); 10 - количество мочи для анализа (мл).

Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание мочевины в крови колеблется в пределах 3,3-8,3 ммоль/л. Около 75% мочевины выделяется с мочой. Концентрация мочевины в крови зависит от интенсивности её синтеза и выделения. Определение мочевины является важным диагностическим тестом, который характеризует не только состояние белкового обмена, но и функциональное состояние почек и печени. Увеличение концентрации мочевины в крови (уремия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), усиленном распаде белков, чрезмерном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором. Снижение уровня мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (гепатодистрофия, цирроз, гепатит), беременности, а также при наследственных дефектах ферментов уреогенеза. В этих условиях наблюдается увеличение содержания в крови аммиака - гипераммониемия. Симптомами гипераммониемии (тошнота, рвота, судороги, потеря сознания, отёк мозга в тяжёлых случаях) являются проявлением её влияния на ЦНС. Увеличение аммиака в моче наблюдается также при разнообразных процессах, которые сопровождаются ацидозом, лихорадкой, диабетом; количество аммиака в моче при диабетическом ацидозе превышает нормальные показатели более чем в 50 раз. Выделение аммиака с мочой уменьшается при некоторых заболеваниях, которые сопровождаются алкалозом (паратиреотропная и детская тетания, эпилепсия, значительная фосфатурия), а также при поступлении в организм щелочей.