1.3.4 Електрофорез у пааг з використанням додецилсульфату натрію

Електрофоретична рухливість кожного білка залежить одночасно й від його сумарного заряду, і від молекулярної маси, і від конфігурації й від твердості упакування поліпептидному ланцюга. Внесок кожного із цих факторів невідомий і може суттєво мінятися залежно від умов форезу. Для встановлення строгої кількісної кореляції між будь-яким з перерахованих параметрів і електрофоретичною рухливістю білків треба виключити вплив усіх інших.

Одним з найбільш популярних методів є електрофорез у ПААГ з використанням додецилсульфату натрію (ДСН), який дозволяє фракціонувати білки залежно від значення тільки одного параметра - їх молекулярної маси.

Основний принцип методу - зниження впливу заряду макромолекули на її електрофоретичну рухливість. У цьому випадку повинна спостерігатися пропорційність між молекулярною масою макромолекули і її опором тертя (коефіцієнтом затримки). Для цього білки обробляють надлишком ДСН, який приблизно однаково зв'язується з переважною більшістю білків у співвідношенні 1.4 мг ДСН з 1 мг білка. Надлишок залишків сульфокислоти робить несуттєвим власний заряд білка, а сталість співвідношення детергент/білок робить практично однаковим відношення негативного заряду до маси для будь-якого білку. Крім того, при обробці білка ДСН поліпептидний ланцюжок розпрямляється й здобуває форму твердого еліпсоїда обертання, розмір великої осі обертання якого лінійно пов'язаний із числом амінокислотних залишків, а отже, з молекулярною масою білка.

Електрофоретична рухливість (u') жорсткого комплексу білок-ДСН виявляється пов'язаної з молекулярною масою білка (Мг) простим співвідношенням:

u' = А-ВlgМr,

де А и В - коефіцієнти, що залежать від пористості гелю, температури й інших умов експерименту. Величину u' зручніше представляти у відносних одиницях шляхів міграції білку й лідируючого барвника за час електрофорезу, тобто в значеннях уведеної раніше величини Rf. Для визначення коефіцієнтів А и В одночасно з фракціонуванням досліджуваної суміші необхідно провести електрофорез набору білків-«маркерів», молекулярні маси яких точно відомі. По закінченню форезу, вимірявши шлях міграції лідируючого барвника (бромфенолового синього) і кожного з маркерів, можна розрахувати значення Rf і, знаючи молекулярні маси маркерів, побудувати експериментальну залежність lgМг від Rf. Якщо пористість гелю обрана вдало, то така залежність буде лінійною. Визначивши тепер Rf для білка, що цікавить нас, з графіку можна знайти для нього величину lgМг і розрахувати Мг.

При даній пористості (концентрації) гелю описана вище лінійна залежність має місце тільки для білків, молекулярні маси яких лежать у певному інтервалі. Для орієнтування можна назвати зразкове значення концентрації акриламіду залежно від молекулярної маси білків:

Т, % 5 10 15

Мг, кДа 18-330 10-100 10-60

Найбільше широко використовуваним варіантом електрофорезу з додаванням ДСН є диск-електрофорез по Леммлі [3]. Цей метод дозволяє значно поліпшити поділ білків, що фракціонуються, за рахунок введення додаткового так званого «формуючого» («концентруючого») крупнопористого гелю, у якому білки не фракціонуються, а тільки концентруються у вигляді дуже вузьких смуг перед переходом у поділяючий гель. Система Леммлі дозволяє добре розділяти білки із Мг = 15-200 кДа. Для аналізу низькомолекулярних білків і пептидів найбільше широко використовується система запропонована Шаггером [4].