- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
а)каждый студент получает одну пробирку с соответствующей культурой бактерий и проверяет её чистоту макро- и микроскопически; препарат-мазок окрасить; по Граму;
б)приготовить взвесь бактерий в физиологическом растворе, стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл физиологического раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть бактерий со среды;
в)с помощью стерильной пипетки перенести взвесь бактерий в стерильную пробирку и прогреть ее для умерщвления бактерий на водяной бане при температуре 70° в течение 30 минут для вибриона и 60 минут для кишечной палочки;
г)установить концентрацию бактерий во взвеси с помощью оптических стандартов, после чего приготовить необходимое разведение антигена.
§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
а)демонстрация различных способов иммунизации животных: подкожный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения антигенов;
б)демонстрация различных способов получения крови от иммунизированных животных: взятие крови из вен у кролика и у лошадей, взятие крови из сердца у кролика и морской свинки.
§ 5. Реакция агглютинации:
а)ориентировочная реакция на стекле. На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;
б)реакция агглютинации в пробирке. В опыт берут две пробирки, специально используемые для реакции агглютинации. В одну из них добавляют 0,5 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:25 (опыт), а в другую - 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл соответствующего антигена, содержащего в I мл I млрд микробных тел. После перемешивания пробирки помещают в термостат на 2 часа при температуре 370, после чего учитывают результат. В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность. При более длительном хранении пробирок (24 часа) в контрольной пробирке также может образоваться осадок, однако при встряхивании пробирок он разрушается и жидкость становится равномерно мутной.
Рис.1 Вибрион. Окраска по Грамму
Рис.2 Реакция агглютинации на стекле (1-опыт; 2-контроль).
Рис.3 Реакция агглютинации в пробирках (1-опыт; 2-контроль).
Контрольные вопросы
Как определяется LD50 по методу Рида и Менча?
Дайте определение понятиям "антиген" и "антитело".
Каковы основные свойства антигена?
Какие виды микробных антигенов Вы знаете?
Что такое анатоксин?
С какой целью применяются микробные антигены?
Что такое диагностикум?
Что такое вакцины?
Как готовится корпускулярный антиген?
Как определяется концентрация бактериальных тел во взвеси?
Что такое оптический стандарт?
Какие методы введения антигенов в организм животного Вы знаете?
Как получают иммунные диагностические сыворотки?
Какими свойствами обладают иммунные сыворотки?
Что такое агглютиноген и агглютинин?
Какие компоненты участвуют в реакции агглютинации?
Как ставится ориентировочная реакция агглютинации на стекле?
Для чего нужен контроль при постановке реакции агглютинации?
Каково практическое применение реакции агглютинации?
Приложение к занятию 9
Антигены - любые вещества, в том числе содержащиеся в микроорганизмах и клетках или выделяемые ими, которые несут признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций.
Антитела - иммуноглобулины, которые вырабатываются клетками лимфойдных органов после парентерального поступления антигена и способны специфически взаимодействовать с ним.
Основные типы иммунологических реакций в организме
1.Синтез антител.
2.Гиперчувствительность немедленного типа.
3.Гиперчувствительность замедленного типа.
4.Иммунологическая память.
5.Иммунологическая толерантность.
6.Идиотип-антиидиотипические взаимоотношения.
Механизм реакции агглютинации
Реакция агглютинации, как любая серологическая реакция, протекает в две фазы.
Первая фаза - специфическое соединение активного центра антитела с детерминантой антигена может происходить в отсутствие электролитов. Эта фаза не сопровождается, видимыми изменениями системы и может быть обнаружена только косвенным путем.
Вторая фаза - склеивание антигенов - следует за первой и ее специфичность менее выражена. Для ее проявления необходимы электролиты, которые снижают электрический заряд комплекса антиген - антитело и ускоряют реакцию. Эта фаза сопровождается видимым изменением среда, склеиванием антигенов и выпадением их в осадок.
Склеивание антигена осуществляется за счет связывания двухвалентными антителами поливалентных антигенов, в результате чего образуются комплексы связанных между собой антигенов через антитела.
Рис.4 Субмолекулярная структура антитела
Обозначения: Ац-активный центр;
V-вариабельный участок тяжелой и легкой полипептидных цепей;
H-тяжелая цепь (450 аминокислот);
L-легкая цепь (212 аминокислот);
S-S-дисульфидная связь;
Fab-Fragment antigen binding;
Fc-Fragment constant;
Рис.5 Вторичная структурв IgG
Обозначения: VL и VH-домены, составляющие вариабельные участки легких и тяжелых цепей;
CL и СH-домены, составляющие константные участки легких и тяжелых цепей.
ЗАНЯТИЕ 10
Дата__________________
Тема: ИММУНИТЕТ. РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ
План занятия
1. Антигены бактериальной клетки. "0"-,"Н"-, "К"-антигены , их свойства. Приготовление "О" и "Н"-антигенов. Реакция агглютинации на стекле с "О" и "Н"-антигенами.
2. Днагноcтикумы, способы приготовления и назначение.
3. Тканевые антигены. Эритроциты. Реакция агглютинации эритроцитов - гемагглютинация.
4. Диагностические агглютинирующие сыворотки. Демонстрация и разбор способов получения поливалентных и монорецепторных сывороток.
5. Понятие о титре агглютинирующей сыворотки. Определение титра агглютинирующей сыворотки, с "Н"-антигеном.
Методические указания