Добавил:

Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Российский государственный аграрный университет МСХА им. Тимирязева

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Лекция_2_ГИ_М_2014

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

24.03.2015

Размер:

6.17 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 83 4 5 6 7 8 > Следующая >>>

Химический синтез фрагментов гена cry3aМ

Синтез комплементарных праймеров фосфорамидитным методом

P	1 (50 bp)	OH	P		2	OH
	P	4	OH	P		3	OH

	P
HO	5
	P
HO	5

отжиг

1	OH	P	2	OH
P HO	4		P HO	3	P
		Достраивание с помощью ДНК-полимеразы
1	OH	P	2	OH
P HO		4	P HO	3	P

Лигирование

Амплификация ПЦР

Клонирование в Т- вектор

Схема клонировании фрагментов cry3aМ

BamHI

Fragment 1

NdeI

Fragment 2

Bsu36

BamHI

Fragment 1

Fragment 2

BamHI Fragment 1

Fragment 2

Fragment 3

Bsu36

Bsu36 Fragment 3 XbaI

XbaI

			XbaI	Fragment 4	XhoI
Полноразмерная	Fragment 1	Fragment 2	Fragment 3	Fragment 4
последовательность
	457 п.н.	357 п.н.	490 п.н.	562 п.н.
гена cry3aM

Новая система экспрессии Cry3a белков в растениях

Эта система основана на использовании гибридных сry3a генов, в состав которых входит последовательность репортерного гена термостабильной лихеназы

Целевой ген	Репортерный
	ген

Необходимо проверить:

•Сохранение свойств целевого и репортерного белков

в составе гибридного белка

Конструкции дрожжевых экспрессионных векторов

Gal

Promoter

Gal

Promoter

Gal

Promoter

pGal-licBM2

licBM2	Poly A

pGal-cry3a-licBM2
cry 3a(Wild)		licBM2

pGal-cry3aM-licBM2
cry3aM (synthetic cry3a)		licBM2

Poly A

М 1 2 3 К-	2 1 3 К-
118	91
85	91

50
33	28
26	28
20
А	Б

Электрофореграмма (А) и зимограмма (Б) белковых экстрактов полученных из клеток дрожжей. М – маркер; K -

отрицательный контроль (pGAL); 1 - Cry3aM-LicBМ2; 2- Cry3a-LicBМ2; 3- LicBМ2 (лихеназа)

105

Вестерн-блот гибридизации нативного, синтетического и гибридных белков:

1 – Cry3a, из клеток E.coli (pET32(а));

2- Cry3a-LicBМ2, из клеток E.coli (pET32(а));

3- Cry3aM-LicBМ2, из клеток E.coli (pET32(а)); 4 - Cry3aM-LicBМ2, из клеток дрожжей;

5 - Cry3a-LicBМ2, из клеток дрожжей; 6 – кристаллический Cry3a.

Биотест дрожжевых экстрактов на личинках колорадского жука

LicBM2

Cry3aM-LicBM2

Белок	LC50 суммарного белка	FL95%
	(μg/mm2)
LicBM2 (K-)	----	----

LicB+ IP Cry3a (K+)	3,8 ±0,3	3,3-4,5
Cry3a-LicBM2	52 ±5	46-57

Cry3aM-LicBM2	6 ±1	5,2-
7,05