- •Государственное образовательное учреждение
- •Введение
- •Тема 1: Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Тема 2: Структурная организация белковых молекул. Методы количественного определения белка.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Количественные методы определения белков
- •Лабораторная работа №2
- •Основные понятия фотоколориметрии
- •Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра
- •Тестовый контроль по теме « Строение белковой молекулы»
- •Тест 10
- •Тема 3 Физико-химические свойства растворов белков. Диализ. Осадочные реакции. Разделение смеси белков методом электрофореза.
- •2. Цель занятия:
- •3. Конкретные задачи:
- •5. Задание для самоподготовки:
- •Практическое применение осадочных реакций
- •Лабораторная работа № 3
- •Реактивы и оборудование
- •II.Диализ
- •III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов
- •Iy.Электрофорез
- •Осадочные пробы на белок
- •Тема 4: "Изучение свойств и биологической роли витаминов водорастворимой группы. Методы исследования свойств витаминов и количественного определения витамина с.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Лабораторная работа № 4 Количественное определение витамина с (аскорбиновой кислоты) в пищевых продуктах и в моче по методу Тильманса
- •Определение содержания витамина «с» в хвое и свежей капусте.
- •Определение содержания витамина «с» в сыром и вареном картофеле и в квашеной капусте.
- •Содержание витамина «с» в различных продуктах и моче
- •Тестовый контроль по теме « Витамины»
- •Установите строгое соответствие
- •3. Конкретные задачи.
- •4. Мотивация.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения.
- •Специфичность действия ферментов
- •Тема 6: "Активация и ингибирование ферментов.
- •3. Конкретные задачи.
- •Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.
- •Клиническое значение определения активности сывороточной хэ.
- •Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов
- •Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях
- •Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, к. Ф. 1.3.99.1) тетразолиевым методом
- •Определение общей активности лактатдегидрогеназы (к.Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов.
- •Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы.
- •Методы определения активности ферментов
- •Тест 15
- •Тема 7: "Энзимодиагностика и энзимотерапия. Клинико-диагностическое значение определения белкового спекра крови."
- •Тема 8 Программа контрольной работы по теме «Химия белков и ферментов. Витамины».
- •195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр.,д. 47
- •394019, Г. Воронеж, ул. Еремеева, 22ж
Основные понятия фотоколориметрии
Фотоколориметрия – один из самых распространенных методов исследования в биохимии и медицине. Основан на измерении поглощения света окрашенным веществом в видимой области спектра от 400 до 800 нм. Метод может быть использован для определения концентрации окрашенного вещества в растворе путем измерения поглощения света при одной или нескольких длинах волн, а также для определения активности ферментов, если субстраты или продукты ферментативной реакции могут быть окрашены с помощью реагентов и поглощать свет в видимой области спектра.
В основе количественных фотоколориметрических методов иссле-дования лежит закон светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера: Интенсивность монохроматического светового потока, прошедшего через слой раствора поглощающего вещества, ослабляется по экспоненциальному закону
I=I010-k C l,
где I - интенсивность светового потока, прошедшего через слой окрашенного раствора,
I0 - интенсивность падающего светового потока,
k- коэффициент светопоглощения,
С - концентрация вещества,
l- толщина слоя раствора.
Более удобна логарифмическая форма закона:
Оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества и толщине слоя раствора
D=ξC l,
где D – оптическая плотность раствора, характеризует поглощение света веществом, D=lgI0/I;
C – молярная концентрация раствора, моль/л;
l - толщина слоя раствора, численно равная рабочему расстоянию кюветы, см;
x - молярный коэффициент светопоглощения
вещества для определенной длины волны света, или молярная экстинкция. Она равна оптической плотности 1М раствора, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см ( при С = 1 моль/л и I = 1 см, D = x), является для данного вещества величиной постоянной. Может быть определена по справочнику или, чаще, определяется экспериментальным путем.
Кроме оптической плотности (D), на практике часто используется величина светопропускания (Т), характеризующая способность окрашенного раствора пропускать световой поток: Т =I/I0, или T(%)=(I*100%)/I0. Обозначения см. выше. Оптическая плотность и величина светопропускания связаны между собой логарифмической зависимостью: D=lg(1/T).
Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера могут быть обусловлены присутствием посторонних примесей в растворе, процессами электролитической диссоциации, гидратации, гидролиза и другими причинами.
Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра
Микроколориметр медицинский фотоэлектрический МКМФ-1 предназначен для измерения коэффициентов пропускания или оптической плотности окрашенных растворов при биохимическом анализе с целью количественного определения различных компонентов биологических растворов.
Диапазон измерений коэффициента пропускания от 5 до 100 %, значений оптических плотностей от 0 до 1,3.
Рабочий спектральный диапазон 420-650 нм обеспечивается светофильтрами. Для выбора светофильтров используют 2 пробы исследуемого вещества различной концентрации и измеряют их оптические плотности с различными светофильтрами. Светофильтр, при котором разность оптических плотностей двух исследуемых проб максимальна, обеспечивает наибольшую чувствительность метода. Выбранный свето-фильтр пропускает лишь тот диапазон длин волн, который максимально поглощается исследуемым веществом.
Таблица для выбора светофильтров
Цвет раствора
|
Область максималь ного погло щения лучей раствором
|
Цвет светофильтра |
Желто-зеленый |
400-500 |
фиолетовый |
желтый |
450-480 |
синий |
Оранже вый |
480-490 |
зелено-синий |
красный
|
480-500 |
сине-зеленый |
Пурпур ный
|
500-560 |
зеленый |
Фиолето вый
|
560-575 |
желто-зеле ный |
синий |
575-590 |
желтый |
зелено-синий
|
590-625 |
оранжевый |
сине-зеленый |
625-700 |
красный |
Микроколориметр работает от сети переменного тока с частотой 50 Гц и номинальным напряжением 220В. Время установления рабочего режима микроколориметра после включения не превышает 1ч.
Микроколориметр измеряет оптическую плотность (D) или коэффи-циент пропускания (T,%) исследуемого раствора относительно контрольного раствора. В качестве контрольного раствора используется кювета с дистилли-рованной водой или контрольным раствором, оптическая плотность которой принимается равной нулю (коэффициент пропускания 100%).
На пути светового пучка поочередно устанавливают контрольный и исследуемый растворы.
Световой поток от лампы накаливания, проходя через оптическую систему и исследуемый раствор в кювете, попадает на светочувствительный слой вакуумного фотоэлемента, который является элементом отсчетно-измерительной схемы. В зависимости от значения коэффициента пропускания исследуемого раствора, изменяется световой поток, прошедший через раствор и падающий на фотоэлемент. При этом изменяется ток фотоэлемента, а следовательно и электрический сигнал, подаваемый на микроамперметр.
Концентрация раствора определяется при помощи калибровочного графика зависимости оптической плотности раствора от его концентрации (по таблице, составленной по данным такого графика) или путем сравнения с эталонным раствором с известной концентрацией вещества.
На лицевой панели прибора расположены следующие органы управления и сигнализации:
- микроамперметр с двумя шкалами: шкалой коэффициентов пропускания (Т,%) и шкалой оптических плотностей (D);
- диод светоизлучающий, сигнализирующий о наличии напряжения питания;
переключатель СЕТЬ для включения микроколориметра;
- ручка переменного резистора УСТАНОВКА НУЛЯ;
- ручка переменного резистора УСТАНОВКА 100% Т;
Непосредственно перед лицевой панелью, на горизонтальной плоскости съемной крышки находятся:
- гнездо для установки рабочих светофильтров;
- кюветное отделение и гнездо для установки контрольных светофильтров, закрывающихся светозащитной крышкой.
Под съемной крышкой укреплена в патроне лампа накаливания - источник света, элементы оптической схемы, а также преобразователь.
На задней панели прибора расположены вставки плавкие, шнур питания, оканчивающийся вилкой штепсельной двухполюсной с заземляющим контактом, гнездо для подключения микропроцессора
ОПТИЧЕСКАЯ СХЕМА МИКРОКОЛОРИМЕТРА
Световой поток от источника I собирается линзовым конденсором 2, который дает изображение нити источника в центре кюветы. На пути луча устанавливается светофильтр 3. В кюветном отделении устанавливается сменная кювета 4. После кюветы свет падает на светочувствительный слой фотоэлемента 5. Перед фотоэлементом может быть установлена заглушка для перекрытия светового потока.
1 2 3 4 5
X ———--à А ————> В ———> С ————> Д
Источник Линзовый Свето- Сменная Вакуумный
света конден- фильтр кювета фотоэлемент
(лампа на- cатор
каливания)
ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ
1. Присоедините микроколориметр к электросети при помощи сетевого шнура с вилкой двухполюсной и заземляющим контактом.
2. Установите в гнездо для рабочих светофильтров фильтр, соответствующий методике измерения биологической пробы.
3. Осмотрите рабочую поверхность кюветы. На них не должно быть видимых глазом грязных пятен, ворсинок и пыли. Наполните кювету дистиллированной водой или контрольным раствором.
4.Установите кювету в кюветное отделение.
5.В гнездо для установки контрольных светофильтров поместите заглушку, предохраняющую фотоэлемент.
6. Закройте крышку кюветного отделения.