5. Понятие полирецепторного профиля связывания токсиканта

Селективное связывание токсиканта с рецепторами одного типа характерно лишь для очень небольшого числа высоко токсичных соединений (например, некоторые ФОС, ботулотоксин, сакситоксин, тетродотоксин, аманитин). Часто вещество имеет примерно одинаковое сродство к нескольким рецепторам, взаимодействие с которыми и приводит к формированию вполне определенного биологического эффекта (профиля токсических реакций). В этой связи, особенности проявлений интоксикации одним и тем же веществом, но различных степеней тяжести, обусловлено не только увеличением количества рецепторов одного типа, связавшихся с токсикантом, но и расширением спектра вступивших во взаимодействие рецепторов. По этой причине, часто, зная проявления интоксикации, мы не можем точно определить, каков механизм их формирования.

Сказанное выше относится к токсикантам с различными механизмами токсического действия, в том числе и действующим на нейромедиаторный аппарат. В малых дозах эти ксенобиотики обычно избирательно действуют на рецепторы какого-то одного типа (например, нейролептики, трициклические антидепрессанты - ТАД - вмешиваются в передачу нервных импульсов в дофаминергических синапсах мозга), однако в высоких дозах действие распространяется и на другие синаптические структуры (упомянутые вещества обладают выраженной холинолитической активностью). В ряде случаев токсический эффект в большей степени связан с взаимодействием ксенобиотика с менее чувствительными, но более значимыми для поддержания гомеостаза рецепторами. Так, интоксикация упомянутыми нейролептиками и ТАД в основном проявляется эффектами, обусловленными блокадой холинергических структур (психодислептические эффекты, вегетативные нарушения, устраняемые в значительной степени ингибиторами холинэстеразы).

В связи с изложенным, важным, при изучении механизмов токсического действия веществ, является определение рецепторного профиля их действия в широком диапазоне доз. В ходе этих исследований изучают виды рецепторов, с которыми может вступить во взаимодействие токсикант и количественные характеристики этого взаимодействия. Обычно задача решается с помощью радиолигандных методов исследования. Сравнение биологических эффектов, вызываемых действием на организм близких по строению, но различающихся по рецепторному профилю токсикантов, позволяет, с определенными оговорками, оценить значение каждого из механизмов формирования токсического процесса.

6. Радиолигандные методы изучения процесса взаимодействия токсиканта с рецепторами

Поскольку токсичность веществ во многом определяется их способностью взаимодействовать с рецепторами определенных типов, количественная оценка сродства конкретного вещества к конкретному рецептору порой имеет решающее значение для выявления механизма его токсического действия.

Количественно оценить сродство токсиканта к рецептору можно с помощью радиолигандных методов исследования. При этом, однако, эффекты, развивающиеся вследствие взаимодействия, остаются вне поля зрения исследователя. Более того, в ходе работы не представляется возможным решить вопрос, является ли исследуемое вещество агонистом или антагонистом (активатором или ингибитором) данного рецептора. Тем не менее, сочетание метода с биохимическими и физиологическими методиками позволяет получить развернутую картину механизма действия токсиканта и формирования ответной реакции биосистемы. К числу наиболее часто используемых относятся радиолигандные методы: а) с полным насыщением рецептора и б) методы замещения радиолиганда.

а). Принцип метода с полным насыщением рецептора состоит в добавлении в инкубационную среду, содержащую рецептор, меченного изотопом токсиканта (радиолиганда) в возрастающей концентрации. Метод пригоден для исследования свойств веществ, прочно фиксирующихся на рецепторе (например, холинолитиков: скополамин, атропина, дитрана и т.д.). В ходе экспериментов с насыщением изучают зависимость количества образовавшегося радиолиганд-рецепторного комплекса (RL) от концентрации радиолиганда (L) при постоянном содержании в среде соответствующих рецепторов (R). После получения необходимых данных (как правило представляемых в графической форме), можно рассчитать количественные характеристики процесса (константу диссоциации комплекса K_D), используя общие положения закона действующих масс.

K_D = [R][L]/[RL] (1)

Поскольку общая концентрация рецепторов, принимавших участие во взаимодействии, представляет собой сумму свободных и связавшихся рецепторов, т.е.

R_O = [R] + [RL] (2)

преобразование уравнения (1) приводит к виду

[RL] = [R_O][L]/(K_D + [L]) (3)

Полученное уравнение по сути идентично уравнению Михаэлиса - Ментен, используемому при описании кинетики ферментативных процессов.

При концентрации свободного лиганда равной величине константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор, имеем

[RL] = [R_O][L]/[L] + [L] = 0,5[R_O] (4)

Таким образом, в упрощенной форме K_D равна концентрации линганда, при которой половина рецепторов приняла участие в образовании лиганд-рецепторного комплекса.

Незначительные преобразования уравнения (3) приводят к линейной зависимости между исследуемыми показателями, что значительно упрощает анализ:

[RL]/[L] = -[RL]/K_D + [R_O]/K_D (5)

Часто для обозначения количества лиганда, связавшегося с рецептором (RL), используют символ (В); свободного лиганда (L) - (F); общего количества рецепторов (R_O) - (B_MAX). Представленное в этих символах выражение (5) выглядит следующим образом:

B/F = -B/K_D + B_MAX/K_D (6)

Исходя из этого выражения может быть рассчитана величина K_D:

K_D = (B_MAX - B)F/B

Зависимость, построенная в координатах (B_MAX - B) - по оси «Х», B/F - по оси «У» как правило носит линейный характер. Угол наклона прямой позволяет определить величину K_D:

B/F = 1/K_D (B_MAX - B)

На рисунке 6 представлены данные радиолигандного исследования связывания мощного холинолитика хинуклидинилбензилата (меченного тритием) с холинорецепторами сердечной мышцы свиньи. Анализ кривых позволяет определить сродство токсиканта к рецепторам соответствующего типа.

Рисунок 6. Кривая связывания радиолиганда [³Н]-хинуклидинилбензилата (³Н-ХНБ) на солюбилизированных мускаринчувствительных холинорецепторах сердца свиньи (G.S. Herron et al., 1982)

Уже в ходе таких простых исследований возникает проблема определения специфичности связывания лиганда. Неспецифическое связывание определяют путем внесения в среду 100 - 1000-кратного избытка не меченного изотопом вещества. Некоторые лиганды, особенно белковой природы, имеют свойство образовывать большое количество неспецифических связей с биосубстратом, иногда до 50% от общего количества образовавшихся комплексов.

б). Исследования методом радиолигандного замещения открывают путь к изучению процесса взаимодействия рецепторов с лигандами, характеризующимся формированием нестабильного комплекса. Это прежде всего характерно для веществ-агонистов соответствующих нейромедиаторов (например, холиномиметиков: никотина, ареколин, карбахола и т.д.). Принцип метода состоит в добавлении в инкубационную среду, содержащую рецептор и радиолиганд-агонист, немеченого изотопом вещества-антагониста в возрастающих концентрациях, до тех пор, пока лиганд полностью не будет вытеснен из связи с рецептором. Концентрация лиганда в опыте должна быть близка величине константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор. В ходе эксперимента обычно определяют концентрацию антагониста, необходимую для вытеснения из связи 50% агониста рецептора. Эта характеристика обозначается как IC₅₀. Константа диссоциации комплекса антагонист-рецептор (К₁) и величина IC₅₀ определяются величиной константы диссоциации агонист-рецепторного комплекса. Если предположить, что количество связанного радиолиганда состовляет лишь незначительную часть вещества в инкубационной среде, а также, что константа диссоциации комплекс значительно превышает величину В_MAX, то имеем:

К₁ = IC₅₀/(1 + F/K_D)

Сравнивая величины констант диссоциации веществ оценивают их сродство к изучаемому рецептору.