3.3. Механизмы активации ксенобиотиков и образования свободных радикалов
Ксенобиотики могут трансформироваться в радикалы как энзиматическим, так и неэнзиматическим путем. Например известны токсиканты, специфично повреждающие тела дофаминергических и серотонинергических нейронов ЦНС (6-гидроксидофамин и 5,7-дигидрокситриптпмин), b-клетки поджелудочной железы (аллоксан) и др., легко подвергающиеся аутоокислению с образованием активных радикалов (рисунок 11). Параллельно с самоокислением молекулы подобного ксенобиотика идет генерация реактивных форм кислорода.
Рисунок 11. Вещества, инициирующие свободно-радикальные процессы путем спонтанного окислительно-восстановительного превращения молекулы в клетках
Ионы металлов с переменной валентностью (медь, железо) облегчают процесс аутоокисления, а восстановители, например аскорбиновая кислота, обеспечивают регенерацию исходной формы ксенобиотика. Таким образом формируется неэнзиматический окислительно-восстановительный цикл токсиканта. SH-соединения, никотиновая кислота в опытах in vitro останавливают процесс.
Ультрафиолетовые лучи активируют превращение (фотоактивация) накапливающихся в коже сульфаниламидных препаратов, 4-аминобензойной кислоты (рисунок 12) и др. в свободно-радикальную форму, которая, как полагают, ответственна за развитие фототоксических и фотоаллергических процессов у лиц, принимающих эти лекарства.
Рисунок 12. Структура о-аминобензойной (антраниловой) кислоты
Длинноволновое ультрафиолетовое облучение (320 - 400 нм) активирует превращение псоралена и его аналогов в свободно-радикальную форму, в которой вещества, повреждают измененные псориатические эпидермальные клетки, образуя фотоаддукты с пиримидиновыми основаниями их ДНК. Наступает ремиссия болезни, но побочным неблагоприятным эффектом является развитие в последующем меланом и сквамозноклеточной карциномы, так как в процессе лечения изменяется генетический код и некоторой части здоровых эпидермоцитов.
Рисунок 13. Окислительно-восстановительный цикл трансформации ксенобиотиков, сопровождающийся активацией свободно-радикальных процессов в клетке. О2* - супероксидный анион; *ОН - гидроксильный радикал
Однако основной путь образования свободных радикалов в клетке - энзиматический метаболизм ксенобиотиков (рисунок 13). Способность веществ метаболизировать с образованием радикалов обычно связывают с величиной их одноэлектронного восстановительного потенциала. Соединения с высокой афинностью к электрону предрасположены к их акцепции и легко восстанавливаются биологическими системами, в то время как вещества с низким сродством к электрону восстанавливаются биосистемами плохо. Вещества, не вступающие в окислительно-восстановительный цикл не являются источниками образования свободных радикалов в клетках. Например, хлороформ (НССl3) является слабым источником прооксидантных процессов из-за низкой способности к оденоэлектронному восстановлению. Напротив, четыреххлористый углерод (CCl4) легко метаболизирует в трихлорметильный радикал (*ССl3), способный отнимать водородные атомы от ненасыщенных жирных кислот, и является инициатором перекисного окисления липидов. Кроме того *CCl3 связывается с липидами микросомальных мембран, активирует кислород, который в свою очередь взаимодействует с макромолекулами (белками, нуклеиновыми кислотами). Восстановление четырёххлористого углерода до трихлорметилового радикала катализируется комплексом оксидаз смешанной функции, состоящим из флавопротеинов, НАДФН-зависимой Р-450 релуктазы, НАДН-цитохром b5 редуктазы и оксидазы цитохрома Р-450.
В процессе метаболизма адриамицина, митомицина С, нитрофурантиона, параквата и некоторых других ксенобиотиков образование промежуточных свободных радикалов идет при участии одной лишь НАДФН-зависимой цитохром Р-450-редуктазы. При этом образовавшиеся радикалы удается выявить только в жестких анаэробных условиях. В присутствии кислорода восстановленные радикалы быстро окисляются до исходной формы, при этом электроны переходят с радикала на молекулу кислорода, что приводит к образованию супероксидного аниона и других его реактивных форм и также активации свободно-радикальных процессов.
Очевидно, что если такой химический окислительно-восстановительный цикл превращения ксенобиотика будет продолжаться в течение достаточно длительного времени, механизмы клеточной защиты могут истощиться и произойдет повреждение клетки. Такая возможность вполне вероятна, поскольку известно, что супероксид-анион инактивирует супероксиддисмутазу, превращает аскорбиновую кислоту и токоферол, а гидроксильный радикал - угнетает глутатионпероксидазу.
Помимо гладкого эндоплазматического ретикулума оксидазы смешанной функции обнаружены в мембране ядра клетки. Поскольку эта мембрана окружает хроматин, активация здесь ксенобиотиков и образование свободных радикалов представляет угрозу ДНК, либо вследствие прямого взаимодействия метаболитов с нуклеиновыми кислотами, либо опосредованно, путем образования реактивных метаболитов кислорода или продуктов перекисного окисления липидов - компонентов ядерной мембраны.
Помимо упомянутых выше, в образовании активных радикалов могут принимать участие и другие энзимы. Так, ксантиноксидаза участвует в метаболизме адриамицина, нитрофурантиола, параквата до продуктов их одноэлектронного восстановления. Тирозиназа, в большом количестве содержащаяся в клетках меланом участвует в образовании многих реактивных метаболитов. Цитоплазматическая диафораза и простогландинсинтетаза облегчают формирование окислительно-восстановительного цикла трансформации параквата, ацетаминофена, бенз(а)пирена и т.д.
Таким образом можно выделить несколько ключевых моментов, имеющих особое значение для реализации повреждающего действия ксенобиотиков на клетку, путем активации свободно-радикальных процессов:
1. Образовавшись, радикал-промежуточный продукт может иметь несколько способов дальнейшего превращения, соотношение между которыми зависит от степени оксигенации клеток (тканей);
2. Усиленное образование свободных радикалов может начаться в нескольких независимых локусах клетки (эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, ядре, цитоплазме);
3. Активация ксенобиотиков до активных радикалов может стать следствием последовательного действия на токсикант нескольких ферментов;
4. Возможно неэнзиматическое образование свободных радикалов. Превращение одного из ксенобиотиков может активировать превращение другого. Так, блеомицин повреждает ДНК в присутствии митомицина С и т.д.
3.4. Биологические последствия активации свободно-радикального процесса в клетке
В результате образования свободных агрессивных радикалов повреждаются самые разные структуры-мишени: липидные мембраны, свободные аминокислоты, полисахариды, нуклеиновые кислоты, рецепторные молекулярные комплексы, транспортные протеины. Итогом такого действия является изменение функционального состояния и гибель клетки, мутация её генетического кода, что, как уже указывалось, на уровне макроорганизма приводит к явлению массивной клеточной гибели (некроз), разрастанию соединительной ткани в органе (фиброз), мутагенезу, развитию новообразований в отдаленные периоды после действия токсиканта.
Характер повреждающего действия активных радикалов во многом определяется их стабильностью и расстоянием на которое они могут мигрировать от места своего образования. В соответствии с этими признаками реактивные метаболиты могут быть разделены на несколько групп.
Наивысшей реакционной способностью обладают промежуточные продукты, образующиеся в ходе так называемого «суицидного метаболизма». Эти продукты разрушают образующие их энзимы. К числу «суицидных» ингибиторов Р-450 относятся, в частности, винилгалогены, некоторые олифены, дигидропиридины, циклопропильные соединения.
Следующими по реакционной способности являются вещества, покидающие область локализации фермент-субстратного комплекса, но активно взаимодействующие с другими протеинами. Примерами веществ, действующих подобным образом являются: ацилгалидный метаболит хлорамфеникола, электрофильный радикал серы, отщепляющийся в ходе метаболизма паратиона и тд.
Менее реакционноспособными являются продукты, мигрирующие в другие локусы клеток и даже за их пределы. Эта группа метаболитов включает большинство промежуточных продуктов. Подобные радикалы способны проникать через биологические мембраны. Это свойство присуще метаболитам бенз(а)пирена, бромбензола, диметилнитрозамина, винилхлорида, трихлорэтилена и т.д.
Еще меньшей раекционной способностью обладают метаболиты, способные выходить за пределы органов, в которых они образуются, и повреждають другие органы и ткани. Примерами этой группы метаболитолв являются: метаболиты гексана - 2,5-гександион, вызывающий периферическую нейропатию, пирролизидиновых алкалоидов - пирролы, мигрирующие из печени в легкие, где действуют на эндотелий сосудов, эпоксиды 4-винилциклогексана, вызывающие поражение яичников.
Механизмы токсического действия свободных радикалов представлены на рисунке 14.
Рисунок 14. Некоторые токсические эффекты свободных радикалов
4. Повреждение мембранных структур
4.1. Основные свойства и функции биологических мембран
1. Плазматическая мембрана. Содержимое клетки отграничено от окружающей среды плазматической мембраной. Благодаря этому поддерживаются условия, позволяющие структурным элементам клетки выполнять присущие им функции. С другой стороны через плазматическую мембрану осуществляется непрерывный транспорт различных молекул, чем и обеспечивается обмен веществом между средой и клеткой. Например плазматическая мембрана печеночной клетки имеет площадь около 8000 мкм2. Такая большая площадь контакта с окружающей средой полностью обеспечивает обмен веществ клетки. Толщина плазматической мембраны составляет около 10 нм. Наконец в мембране локализуются белковые структуры, формирующие ионные каналы, рецепторы для физиологически активных веществ, обеспечивающие восприятие сигналов, регулирующих биологическую активность клетки (см. ниже).
Мембрана образована двумя слоями молекул липидов, гидрофобные части которых направлены друг к другу, а гидрофильные в сторону окружающей и внутренней среды клетки. Основные группы липидов - фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, сфингомиелин), гликолипиды, нейтральные липиды (холестерол и т.д.). Молекулы липидов легко диффундируют в липидных слоях. Время нахождения отдельной молекулы на неизменной позиции составляет 10-8 - 10-9 сек. Обмен молекулами между слоями осуществляется редко. Распределение молекул различного строения между слоями асимметрично.
В мембрану встроены белковые молекулы, которые часто пронизывают всю ее толщу, либо погружаются на различную глубину, локализуясь на внешней или внутренней стороне. Углеводный компонент клеточной мембраны представлен главным образом гликопротеинами. Они располагаются на внешней поверхности мембраны. Мембраны различных клеток существенно различаются по своему строению и функциям. В клеточной мембране печени обнаруживается около 20 энзимов. Активность энзимов во многом зависит от липидного состава мембран. Особыми свойствами обладают возбудимые мембраны нервной, мышечной и железистой тканей. Изменение их свойств в ответ на стимул являются важнейшим звеном цепи биологических процессов, лежащих в основе формирования реакции организма на внешние и внутренние раздражители.
Плазматические мембраны, несмотря на преимущественно липидный состав, способны пропускать низкомолекулярные водорастворимые вещества, так как содержат поры со средним диаметром 0,7 - 1,0 нм. Полагают, что поры, заполненные водой, сформированы белковыми молекулами. Объем воды, содержащейся в мембранах составляет от 30 до 50% от общего объёма мембран. Максимальная молекулярная масса водорастворимого вещества, способного проникать через плазматические мембраны, - около 200 дальтон.
Клеточные мембраны чрезвычайно динамичный элемент. Их строение изменяется в соответствии с условиями окружающей среды и потребностями клетки. Увеличение площади поверхности растущей клетки осуществляется за счет слияния клеточной мембраны с синтезируемыми в цитоплазме (аппарат Гольджи) микровезикулами. Этот же процесс обнаруживается и у не растущих секреторных и нервных клеток, которые путем отшнуровывания микровезикул выделяют в окружающую среду биологически активные вещества (гормоны, нейромедиаторы).
Известен и противоположный процесс - поступления необходимых веществ из окружающей среды в клетку, путем захвата фрагментом клеточной мембраны субстрата, погружением его в цитоплазму и отшнуровывания от остальной мембраны. Слияние мембраны с везикулами и их отшнуровывание обеспечивают динамичность её состава.
Важными свойствами клеточной мембраны является её электрический заряд и электрическая проводимость. Наружная стороны мембраны клеток в состоянии покоя заряжена положительно. Полярность мембраны определяется отчасти асимметричностью липидных слоев, отчасти наличием в её составе белковых молекул и гликопротеинов. Особое значение имеет градиент концентрации ионов по обе стороны мембраны, поддерживаемый благодаря энергозатратным процессам. Таким образом свойства мембраны и обмен веществ в клетке тесно связаны. Вещества, вмешивающиеся в обмен липидов, существенно влияют на свойства биологических мембран.
2. Цитоплазматические мембраны. Внутри клеток имеются многочисленные мембранные структуры, образующие эндоплазматический ретикулум, мембрану ядра клетки, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы. Эти структуры образованы двумя слоями биологической мембраны. Между этими слоями имеется пространство толщиной около 10 нм. Общая толщина внутриклеточных мембран - около 25 нм.
Мембрана клеточного ядра представляет собой специализированный отдел эндоплазматического ретикулума. Пространство, находящееся между двумя листками мембраны, по-видимому сообщается с межклеточным пространством. Этим путем токсиканты могут проникать непосредственно в ядро, минуя цитоплазму, что прослеживается, в частности, при поступлении в клетку акридиновых красителей. Ионы Na+ также поступают в ядро из экстрацеллюлярной жидкости по эндоплазматическому ретикулуму. Наличие пор в ядерной мембране диаметром 50 - 100 нм обеспечивает обмен веществом между ядром и цитоплазмой. Даже макромолекулы (РНК, энзимы и др.) проходят через мембрану путем простой диффузии.
Цитоплазматические мембраны служат организующим субстратом для объединение в единый комплекс ряда энзиматических систем. Например мембраны митохондрий представляют собой сложную мозаику взаимодействующих энзиматических групп. Складчатость мембран способствуют увеличению площади их поверхности и тем самым интенсификации обменных процессов. Общая площадь мембран митохондрий печеночной клетки оценивается в среднем в 29000 мкм2. В качестве матрикса для энзимов выступают и другие мембранные структуры: гладкий и шероховатый эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи. Эти структуры участвуют в обмене веществ. Так, на рибосомах, локализующихся на мембранах шероховатого ретикулума, осуществляется синтез белка; энзимы гладкого эндоплазматического ретикулума - важнейший элемент метаболизма ксенобиотиков; аппарат Гольлджи - основная секреторная структура клетки. В зависимости от функционального состояния изменяется не только интенсивность биохимических процессов, но и морфология упомянутых структур. Так, митохондрии печеночных клеток, находящиеся в активном состоянии, имеют продолговатую форму, а в состоянии покоя - сферическую, количество крист в них сокращается.
Токсическое действие многих веществ сопряжено с их влиянием на состояние мембранных структур. Оно может быть прямым и опосредованным. Наиболее вероятными механизмами опосредованного повреждения биологических мембран при интоксикациях являются:
- активация перекисного окисления липидов (см. выше);
- активация фосфолипазной активности.
4.2. Действие токсикантов на мембраны
4.2.1. Прямое действие на мембраны
Возможно действие ксенобиотиков непосредственно на липидный бислой или белковые компоненты биомембран. Развивающиеся вследствие этого эффекты могут быть как неспецифичными (отсутствие строгой зависимости между структурой токсиканта и развивающимся эффектом), так и строго специфичными. Специфичность является следствием действия токсикантов на энзимы и рецепторные белковые комплексы (см. выше). Часто действие носит смешанный «полуспецифичный» характер.
В результате неспецифического действия многочисленных токсикантов (бензола, толуола, динитробензола, хлороформа, мылов, сапонинов, смачивающих веществ, тяжелых металлов и других денатурирующих агентов) может нарушаться структурная целостность мембран, что приводит к деформации, лизису клетки и её гибели. При действии таких веществ на мембраны эритроцитов развивается гемолиз.
Действуя в малых дозах на возбудимые мембраны нервных клеток ЦНС, органические растворители, спирты вызывают седативно-гипнотический. В действии этих соединений, помимо неспецифических, прослеживаются и отчетливые специфические механизмы. Так, вещества со свойствами «неэлектролитов» накапливаясь в мембранах, одновременно изменяют их проницаемость для ионов Na+, K+, Ca+2, Cl- (рис. 15).
Рисунок 15. Возможные механизмы непосредственного действия токсикантов на биологические мембраны
Многие токсиканты избирательно действуют на мембраносвязанные энзимы, транспортные системы, рецепторные комплексы к биологически активным веществам. К числу таких в частности относятся гликозиды, агонисты и антагонисты нейромедиаторов и гормонов, блокаторы ионных каналов и многие другие.