3.5. Определение кажущихся констант диссоциации комплекса агонист-рецептор

В то время, как прямая связь между значениями величин рА₂ и рD*₂ антагонистов с одной стороны и констант диссоциации комплекса антагонист-рецептор с другой признается хотя бы теоретически, связь между рD₂ и К_А агониста таковой, в строгом смысле не является, поскольку между этапом образования комплекса агонист-рецептор и этапом формирования эффекта лежит цепь промежуточных звеньев биохимических и физиологических реакций, как правило далеко не изученных (см. выше). Из этого следует, что непосредственно определить сродство токсиканта к рецептору (т.е. величину константы диссоциации комплекса токсикант-рецептор) исходя из зависимости «доза-эффект», получаемой в эсперименте, не возможно. Для преодоления этой сложности предлагается определять величину кажущейся константы диссоциации. Классическим является метод с использованием необратимого конкурентного антагониста.

В 1956 году Nickerson установил, что алкилирующие соединения типа b-галогеналкиламинов, например дибенамин и феноксибензамин, могут вступать в необратимое взаимодействие с рецепторами различных типов. Связываются рецепторы к ацетилхолину, гистамину, серотонину, a-адренорецепторам. Изучая совместное взаимодействие ингибиторов и агонистов с биопрепаратами удалось:

- установить специфический характер действия галогеналкиламинов на агонист-связывающую область рецепторов;

- уточнить классификацию рецепторов в соответствии с их сродством к эндогенным агонистам.

Furchgott предложил метод, основанный на сравнении эквиэффективных доз агониста, дествующего на интактный бипрепарат и препарат, обработанный предварительно ингибитором рецепторов (уменьшение [R]_T на величину q[R]_T).

Эффект, связанный с действием агониста до блокады рецепторов описывается уравнением (13), после блокады - уравнением (14). Одинаковый по выраженности эффект в этих условиях развивается при одинаковой величине стимула S. Если S = S*, то Е_А/Е_М = Е_А*/Е_М*, и тогда, комбинируя уравнения 13 и 14 получаем

1/[A] = 1/q 1/[A] + (1-q)/qK_A (23)

Выстраивая зависимость в координатах 1/[А] и 1/[А*] получаем прямую с углом наклона 1/q и отрезок на оси 1/[А], равный (1-q)/qK_A. Для практического определения К_А можно использовать выражение

K_A = (наклон - 1)/отрезок

Процесс подготовки данных представлен на рисунке 8:

Рисунок 8. Определение величины кажущейся константы диссоциации агонистов на мускариночувствительный рецептор продольной мышцы тонкой кишки морской свинки.

а). Кривая зависимости доза-эффект ацетилхолина для интактного препарата (q = 1), и препарата, обработанного в течение 20 минут фенокисбензамином (5мкМ) (q = 0,1624).

б). Построение графика соотношения равноэффективных доз для интактного и обработанного препарата в координатах 1/[А] и 1/[А*] приводит к прямой, на основе которой (а также уравнения 23) можно вычислить значения константы диссоциации.

4. Зависимость «доза-эффект» в группе

4.1. Зависимость «доза-эффект» для одного токсиканта

При изучении зависимости «доза-эффект» в группе, состоящей из большого количества особей, можно исходить из представлений, развитых при изучении зависимости на уровне отдельного организма. Дополнительным фактором, влияющим на получаемый результат является индивидуальная изменчивость.

Однако хотя реакция отдельных людей или животных в группе на токсикант не одинакова, по мере увеличения действующей дозы тем не менее будет увеличиваться и выраженность эффекта и количество индивидов (особей), у которых развивается оцениваемый эффект. Например, если на кожу испытуемых апплицировать вещество, вызывающее раздражение (ирритант), то по мере увеличения количества наносимого токсиканта будут отмечаться: - увеличение числа испытуемых, у которых разовьется реакция раздражения; - увеличится выраженность явления раздражения у испытуемых. Из этого следует, что получаемые в ходе работы величины должны определяться с учетом статистических закономерностей.

При изучении действия токсиканта на организм следует различать эффекты, выраженность которых градуально зависит от действующей дозы (например понижение артериального давления) и эффекты типа «все или ничего» (пал/выжил). При этом следует учитывать, что эффекты первого типа можно практически всегда преобразовать в форму, пригодную для оценки эффектов второго типа. Для определения зависимости «доза-эффект» в группе обычно прибегают к двум типам построения эксперимента:

- с образованием подгрупп исследуемых животных;

- без образования подгрупп.