Тема 2. Метаболизм липидов и его регуляция

К липидам относят разнообразные слабополярные органические соединения, плохо растворимые в воде и растворимые в органических неполярных растворителях.

По химическому составу можно выделить несколько групп липидов: сложные эфиры спиртов и жирных кислот (ацилглицеролы, воска), сфинголипиды (сфингофосфолипиды и сфингогликолипиды), эйкозаноиды, стероиды и терпены. По свойствам выделяют также нейтральные липиды (триацилглицеролы, воска, стероиды) и полярные липиды (фосфо-, гликолипиды).

Жирные кислоты, являясь энергетически емкими молекулами, окисляются в организме с выделением энергии или запасаются в составе триацилглицеролов, главным образом в адипоцитах жировой ткани. Фосфо- и гликолипиды являются основными компонентами биомембран. Эйкозаноиды представляют собой производные полиненасыщенных жирных кислот (прежде всего, арахидоновой кислоты) и подразделяются по особенностям структуры и функций на простагландины, лейкотриены и тромбоксаны. Эйкозаноиды выполняют регуляторные функции. К стероидам относятся холестерин и его производные – желчные кислоты, стероидные гормоны, витамин D. Холестерин является необходимым компонентом клеточных мембран.

В организм человека и животных с пищей поступают, в основном, триглицериды (жиры и масла) и холестерин.

Расщепление триглицеридов (липолиз) протекает ступенчато с образованием промежуточных продуктов диглицеридов, моноглицеридов и жирных кислот. Эмульгирование жиров желчными кислотами в 12-перстной кишке облегчает переваривание и всасывание жирных кислот.

Внутриклеточный катаболизм липидов включает расщепление триглицеридов под действием тканевых липаз с последующим окислением глицерина (в гликолизе и далее в цикле Кребса) и жирных кислот (-окисление в митохондриях). Образовавшийся ацетил-КоА далее может окислиться в цикле Кребса или использоваться для синтеза других жирных кислот или холестерина. Значительная часть жирных кислот может использоваться для синтеза мембранных липидов.

Холестерин, поступающий с пищей и синтезированный в организме, может включаться в мембранные структуры или использоваться для получения биологически активных производных, указанных выше.

Как и обмен углеводов, липидный обмен регулируется гормонально – адреналином, глюкагоном, инсулином. Инсулин активирует биосинтез жиров, а также увеличивает содержания НАДФН, образующегося в пентозофосфатном пути. Адреналин и глюкагон, а также глюкокортикоиды активируют липазу жировой ткани и способствуют утилизации жиров.

Лабораторная работа 6. Определение содержания общих липидов в сыворотке крови

Содержание общих липидов в сыворотке крови часто используется для лабораторной диагностики, как один из показателей липидного обмена.

Принцип метода: продукты распада ненасыщенных липидов образуют с ванилиновым реактивом окрашенные соединения. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации липидов в пробе.

Материалы и реактивы:

1. Концентрированная серная кислота.

2. Фосфорнованилиновый реактив: 10 мМ ванилин,

11,5 М ортофосфорная кислота.

3. Калибратор липидов – 8г/л.

Ход работы:

Анализ проводят в соответствии со схемой, представленной в таблице.

Отмерить в пробирку, мл	Опытная проба	Стандарт	Холостая проба
Сыворотка крови	0,01	–	–
Серная кислота, конц.	1,0	1,0	1,0
Калибратор липидов	–	0,01	–
Смешать и разогреть на кипящей водяной бане 10 минут. После охлаждения пробирок 5 минут холодной водой осторожно отмерить в пробирки
Фосфорнованилиновый реагент	2,0	2,0	2,0
Содержимое смешать, пробирки инкубировать 25 минут при температуре от +20 0С до +25 0С в темноте, затем охладить 2 минуты в холодной воде, не более чем через 10 минут измерить оптическую плотность опытной пробы и стандарта при 540 нм и длине оптического пути 0,5 или 1 см против холостой пробы.

Расчет осуществляют по формуле

где С – концентрация общих липидов в пробе, г/л;

Е₁ – экстинкция опытной пробы;

Е₂ – экстинкция стандарта;

8,0 – концентрация общих липидов в калибровочном растворе, г/л.

Клинико-диагностическое значение. Содержание общих липидов в сыворотке крови здоровых людей составляет от 4 до 8 г/л. Физиологическая (алиментарная) гиперлипемия развивается через 2–3 ч после приема пищи, богатой жирами и максимальных значений достигает через 4–6 ч.

Повышение содержания общих липидов в сыворотке крови наблюдается при ряде заболеваний: диабете (снимается введением инсулина), липоидном нефрозе, токсикозах, циррозе, остром гепатите, ожирении, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, гипотериозе, панкреатите, злоупотреблении алкоголем, а также при голодании. Снижение содержания липидов в сыворотке крови обнаруживается при гипертиреозе, гипотрофии и т. д.

Лабораторная работа 7. Определение содержания холестерина в сыворотке крови методом Илька

Биохимические исследования содержания в крови холестерина и его эфиров имеют важное диагностическое значение. Наиболее распространенным заболеванием, связанным с нарушениями обмена холестерина, является атеросклероз. При атеросклерозе содержание холестерина в сыворотке крови увеличивается и происходит его отложение в стенках артерий.

Принцип метода.Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси концентрированных серной и уксусной кислот дает изумрудно-зеленое окрашивание (цветная реакция Либермана–Бурхарда), интенсивность которого пропорциональна содержанию холестерина в пробе.

Материалы и реактивы:

1. Реактив на холестерин: 75–85 % уксусный ангидрид,

15–25 % уксусная кислота;

2. Калибровочный раствор холестерина ((4,665  0,2328) мМ;

3. Концентрированная серная кислота.

Ход работы. Анализ проводят в соответствии с таблицей.

Отмерять в кювету, мл	Опытная проба	Холостая проба	Калибровочная проба
Рабочий раствор	4,30	4,30	4,30
Анализируемый раствор	0,10	-	-
Физиологический раствор	-	0,10	-
Калибровочный раствор холестерина	-	-	0,10
В рабочий раствор медленно, по стенке пробирки, прибавляют негемолизированную сыворотку или калибровочный раствор. Пробирку энергично встряхивают 10–12 раз и выдерживают в термостате при + 37 0С в течение 20 мин. Измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против холостой при 630–690 нм и длине оптического пути 5 мм.

Расчет осуществляется согласно формуле

,

С – концентрация в опытной пробе, мМ;

Е_опыт. – экстинкция опытной пробы, ед. опт. плотности;

Е_{калибр.} – экстинкция калибровочной пробы, ед. опт. плотности;

4,665 – концентрация холестерина в калибровочном растворе, мМ.

Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание холестерина в крови человека составляет 3,0–6,26 мМ. Увеличение содержания холестерина в крови – наиболее достоверный фактор риска развития коронарного атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда. Наиболее высокий уровень холестерина зафиксирован при генетических нарушениях в обмене липопротеинов. Вторичная гиперхолестеринемия наблюдается при заболеваниях печени, заболеваниях почек (гломерулонефрите, нефротическом синдроме с отёками, хронической почечной недостаточности), злокачественной опухоли поджелудочной железы, гипертонической болезни, эндокринных заболеваниях. Очень высокое содержание холестерина в крови (в 5 раз выше нормального) отмечено при сахарном диабете и липоидном нефрозе.

В ка­честве веществ гипохолестеринемического действия применя­ются некоторые ингибиторы биосинтеза холестерина.

Гипохолестеринемия наблюдают в период голодания, при гипотиреозе, острых инфекционных заболеваниях, пневмонии, бронхите, анемии, гемолитической желтухе, злокачественных опухолях печени, остром гепатите и др.

Лабораторная работа 8. Качественная проба на кетоновые тела

Кетоновые тела (ацетоацетат, -гидроксибутират и ацетон) синтезируются в митохондриях печени из ацетил-КоА. В условиях снижения утилизации глюкозы тканями (голодание, сахарный диабет, смена диеты и др.) синтез кетоновых тел значительно усиливается, кетоновые тела поступают из печени в кровь и используются как источники энергии в других органах и тканях.

Ход работы. В пробирку поместить 2–3 мл мочи, содержащей кетоновые тела, прибавить несколько капель свежеприготовленного раствора нитропруссида Na, затем несколько капель 10 % раствора NaOH и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Жидкость окрашивается в вишнево-красный цвет, что указывает на присутствие ацетоуксусной кислоты и ацетона.

Клинико-диагностическое значение. Содержание кетоновых тел в плазме крови здорового человека очень невелико – до 10 мг/л. С мочой в сутки выделяется 20–40 мг кетоновых тел.

Увеличение количества кетоновых тел в крови (кетонемия) и моче (кетонурия) наблюдается при сахарном диабете, дефиците углеводов в питании (углеводное голодание), тиреотоксикозе, поражении печени, тяжелых интоксикациях.

Лабораторная работа 9. Фурфуроловая проба на жёлчные кислоты

Желчные кислоты являются производными холестерина и участвуют в эмульгировании липидов пищи. Реакция обусловлена образованием окрашенных в красный цвет продуктов конденсации жёлчных кислот с оксиметилфурфуролом. Оксиметилфурфурол образуется при взаимодействии сахарозы с концентрированной серной кислотой.

Ход работы. К 10 каплям разведенной в 3 раза желчи добавить 1 каплю 5 % раствора сахарозы и осторожно по стенке подслоить 1 мл концент­ри­ро­ван­ной серной кислоты. На границе раздела 2-х жидкостей появляется окрашенный в красноватый цвет продукт конденсации желчных кислот с образовавшимся из сахарозы оксиметилфурфуролом.

Клинико-диагностическое значение

При механической желтухе вследствие закупорки общего желчного протока камнем или опухолью желчные капилляры переполняются желчью, и желчь проникает в кровь. В этом случае происходит усиленное выделение желчных пигментов (билирубин, биливердин) и желчных кислот с мочой.

Контрольные вопросы по теме «Метаболизм липидов и его регуляция»:

1. Катаболизм триацилглицеролов в адипоцитах жировой ткани: последовательность реакций, механизмы регуляции активности триацилглицероллипазы.

2. Нейрогуморальная регуляция липолиза с участием адреналина, норадреналина, глюкагона и инсулина.

3. Реакции окисления жирных кислот (β-окисление); роль карнитина в транспорте жирных кислот в митохондрии.

4. Энергетический баланс β-окисления жирных кислот в клетках.

5. Окисление глицерола: ферментативные реакции, биоэнергетика.

6. Кетоновые тела. Реакции биосинтеза и утилизации кетоновых тел, физиологическое значение.

7. Нарушение обмена кетоновых тел при патологиях (сахарный диабет, голодание).

8. Биосинтез высших жирных кислот: реакции биосинтеза высших жирных кислот и регуляция процесса.

9. Биосинтез моно- и полиненасыщенных жирных кислот в организме человека.

10. Биосинтез триацилглицеролов и фосфолипидов.

11. Метаболизм сфинголипидов. Генетические аномалии обмена сфинголипидов – сфинголипидозы.

12. Биосинтез холестерола: схема реакций, регуляция синтеза холестерола.

13. Пути биотрансформации холестерола: этерификация, образование жёлчных кислот, стероидных гормонов, витамина D₃.

14. Циркуляторный транспорт и депонирование липидов в жировой ткани. Липопротеинлипаза эндотелия.

15. Липопротеины плазмы крови: липидный и белковый состав. Гиперлипопротеинемии.

16. Патологии липидного обмела: атеросклероз, ожирение, сахарный диабет.

17. Биохимический состав, строение и функции биологических мембран.

18. Компартментализация биохимических процессов в клетках.

19. Роль липидов в построении биологических мембран. Жидкостно-мозаичная модель биомембран.