- •Экзаменационный билет № 1
- •Экзаменационный билет № 2
- •Экзаменационный билет № 3
- •Экзаменационный билет № 5
- •Экзаменационный билет № 6
- •Экзаменационный билет № 7
- •Экзаменационный билет № 8
- •Экзаменационный билет № 9
- •Экзаменационный билет № 10
- •Экзаменационный билет № 11
- •Экзаменационный билет № 12
- •Экзаменационный билет № 13
- •Экзаменационный билет № 14
- •Экзаменационный билет № 15
- •Экзаменационный билет № 16
- •Экзаменационный билет № 17
- •Экзаменационный билет № 18
- •Экзаменационный билет № 19
- •Экзаменационный билет № 20
- •Экзаменационный билет № 21
- •Экзаменационный билет № 22
- •Экзаменационный билет № 23
- •Экзаменационный билет № 24
- •Экзаменационный билет № 25
Экзаменационный билет № 23
Методы культивирования вирусов.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.
Особенности строения грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.
Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.
Функции клеточной стенки: 1. Обусловливает форму клетки. 2. Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление. 3. Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества. 4. Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.
L-формы бактерий, их медицинское значение L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению.
Цитоплазматическая мембрана располагается под клеточной стенкой (между ними - периплазматическое пространство). По строению является сложным липидобелковым комплексом, таким же, как у клеток эукариот (универсальная мембрана).
Функции цитоплазматической мембраны: 1. Является основным осмотическим и онкотическим барьером. 2. Участвует в энергетическом метаболизме и в активном транспорте питательных веществ в клетку, так как является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного фосфорилирования. 3. Участвует в процессах дыхания и деления. 4. Участвует в синтезе компонентов клеточной клетки (пептидогликана). 5. Участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.
Цитоплазматическая мембрана выявляется только при электронной микроскопии.
Возбудитель сифилиса. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Лечение.
Treponema palladium ; T. entericum
Морфология: типичные трепонемы. имеющие 8-12 завитков, двигательный аппарат – 3 периплазматических жгутика у каждого полюса клетки. Окраску по Граму не воспринимают, по Романовскому-Гимзе – слабо розового цвета, выявляется импрегнацией серебром.
Культуральные свойства: вирулентный штамм на пит. средах не растёт, накопление культуры происходит путём заражения кролика в яичко. Вирулентные штаммы культивируют на средах с мозговой и почечной тканью.
Биохимические свойства: микроаэрофил
Антигенная структура: солжная, обладает специфическим белковым и липоидным антигенами, последний по своему составу идентичен кардиолипину, , экстрагированному из бычьего сердца ( дифосфадилглицерин )
Факторы патогенности: в процессе прикрепления участвуют адгезины, липопротеины учавствуют в развитии иммунопатологических процессов.
Резистентность: чувствителен к высыханию, солнечным лучам, на предметах сохраняется до высыхания. При неблагоприятных условиях переходит в L-формы и образует цисты.
Патогенез: Вызывают сифилис. Из места входных ворот трепонемы попадают в регионарные лимфатические узлы, где размножаются. Далее Т. проникает в кровяное русло, где прикрепляется к эндотелиоцитам, вызывая эндартерииты, приводящие к васкулитам и тканевому нектрозу. С кровью Т. разносится по всему организму, обсеменяя органы: печень, почки, костную, сердечно-сосудистую, нервную системы.
Иммунитет: защитный иммунитет не вырабатывается. В ответ на антигены возбудителя развивается ГЗТ и аутоиммунные процессы. Гуморальный иммунитет вырабатывается на липоидный антиген Т. и представляет собой титр IgA и IgM.
Микроскопическое исследование. Проводят при первичном сифилисе во время появления твердого шанкра. Материал для исследования: отделяемое шанкра, содержимое регионарных лимфатических узлов, из которых готовят препарат «раздавленная» капля и исследуют в темном поле. При положительном результате видны тонкие извитые нити длиной 6—14 мкм, имеющие 10—12 равномерных мелких завитков правильной, формы. Для бледной трепонемы характерны маятникообразные и поступательно-сгибательные движения. При развитии поражений на слизистой оболочке рта при вторичном сифилисе, а также при локализации твердого шанкра в полости рта приходится дифференцировать бледную трепонему от сапрофитных трепонем, являющихся представителями нормальной микрофлоры. В этом случае решающее диагностическое значение имеет обнаружение типичных трепонем в пунктате регионарных лимфатических узлов.
Серодиагностика. Реакцию Вассермана ставят одновременно с 2 антигенами: 1) специфическим, содержащим антиген возбудителя— разрушенные ультразвуком трепонемы; 2) неспецифическим — кардиолипиновым. Исследуемую сыворотку разводят в соотношении 1:5 и ставят РСК по общепринятой методике. При положительной реакции наблюдается задержка гемолиза, при отрицательной—происходит гемолиз эритроцитов; интенсивность реакции оценивается соответственно от ( + + + + ) До ( —). Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50 % больных реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 нед после появления твердого шанкра. Во втором и третьем периодах сифилиса частота положительных реакций достигает 75— 90 %. После проведенного курса лечения реакция Вассермана становится отрицательной. Параллельно реакции Вассермана ставится реакция микропреципитации с неспецифическим кардиолипиновым антигеном и исследуемой инактивированной сывороткой крови или плазмой. В лунку на пластине из плексигласа (или на обычное стекло) наносят 3 капли сыворотки и добавляют 1 каплю кардиолипинового антигена. Смесь тщательно перемешивают и учитывают результаты. Положительная реакция е сывороткой крови больного сифилисом характеризуется образованием и выпадением хлопьев разной величины; при отрицательном результате наблюдается равномерная легкая опалесценция.
РИФ — реакция непрямой иммунофлюоресценции — является специфической при диагностике сифилиса. В качестве антигена используют взвесь тканевых трепонем. Используется реакция РИФ_200. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят в соотношении 1:200. На предметные стекла наносят капли антигена, высушивают и фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыворотку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Следующим этапом является обработка препарата флюоресцирующей сывороткой против глобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.
РИТ—реакция иммобилизации трепонем — также является специфической. Живую культуру трепонем получают при культивировании в яичке кролика. Яичко измельчают в специальной среде, в которой трепонемы сохраняют подвижность. Ставят реакцию следующим образом: взвесь тканевых (подвижных) трепонем соединяют в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный — неактивный. После выдерживания при 35 °С в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат «раздавленная» капля и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем.
Лечение: Пенициллины, тетрациклины, висмутсодержащие препараты.