Экзаменационный билет № 12

1. Структура и химический состав бактериофагов.

Бактериофаг – вирус, избирательно поражающий бактериальные клетки. Как и прочие вирусы, во внеклеточной форме бактериофаги являются метаболически инертными частицами. Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, строению фаговой частицы, морфологии негативных колоний, характеру взаимодействия с микробными клетками.

Для обозначения бактериофагов используются буквы латинского и греческого алфавитов. В частности хорошо изучены фаги кишечной палочки.

Большинство из фагов относятся к сложным вирусам и состоят из хорошо сформированной икосаэдрической (кубической) головки и хвоста (отростка) различной степени выраженности, иногда имеющего дополнительные структуры. Все структуры отростка имеют белковую природу. Размер фага колеблется от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки – от 60 до 100 нм, длина отростка – 100–200 нм. Длина хвоста, как правило, в 2–4 разабольше диаметра головки.

Головка состоит из генетического материала (двух цепочечной или одноцепочечной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) с ферментом транскрипаза в неактивном состоянии) и капсида (белковой оболочки). Нуклеиновая кислота и капсид вместе образуют нуклеокапсид.

Хвост представляет собой белковую полую трубку окруженную чехлом, содержащим сократительные белки. Чехол является продолжением белковой оболочки головки. В основании хвоста находится АТФ-аза, регенерирующая энергию для инъекции генетического материала (сокращения чехла отростка бактериофага). У некоторых вирусов чехол сокращается, обнажая часть стержня. На конце хвоста у многих фагов присутствует базальная пластинка с тонкими длинными нитями, способствующими прикреплению его к бактерии. Кроме того в области базальной пластинки присутствует фермент – бактериофаговый лизоцим, способный разрушать муреин клеточной стенки бактерии.

Бактериофаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. Общее количество белка – 50–60%, нуклеиновых кислот – 40–50 %. В составе некоторых фагов имеются ДНК с азотистыми основаниями. Вместо цитозина может присутствовать5-оксиметилцитозин. Внутри головки фага Т2 обнаружен белок с полиамидами в составе. Он способствует суперспирализации ДНК и способствует размещению достаточно длинной ДНК в головке небольшого размера. В частицах многих фагов под чехлом присутствует фермент лизоцим

2. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Для определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качес­твенный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиоти­ка в крови должна быть значительно выше ми­нимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования ус­тойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с ин­струкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувстви­тельность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в буль­оне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добав­ляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶—10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питатель­ной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя про­бирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержа­щейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаружи­ваемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, созда­ющиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост кото­рых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пеницил­лина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но 1 :1024, а минимальная концентрация эталонного антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концен­трацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лакта-мазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска

3. Гонококки. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика гонореи. Лечение.

Нейсcерии – грамотрицательные аэробные кокки, относящиеся к роду Neisseria, включающему 8 видов: Neisseria meningitides, Niesseria gonorrhoeae, N. flava, N. subflava, N. perflava, N. sicca.

Морфология: неподвижные неспорогенные грамотрицательные диплококки, образующие капсулу, полиморфны – встречаются в виде мелких или крупных форм а так же в виде полочек, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями (метиленовым синим, бриллиантовым зелёным и т. д.), под действием пенициллина образуют L-формы, могут менять свойства и превратиться в грамположительную форму.

Культуральные свойства: аэробы, хемоорганотрофы; для роста требуют свежеприготовленные влажные среды с добавлением нативных белков крови, сыворотки или асцитической жидкости . Не вызывают гемолиза на средах, содержащих кровь; на средах с добавлением молока, желатина и картофеля не растут. На плотных питательных средах через 24ч, при содержании протеина II образуют слегка мутные бесцветные колонии, не содержащие его образуют круглые прозрачные колонии в виде капель росы, на жидких питательных средах растут диффузно и образуют плёнку, через несколько часов оседающую на дно.

Биохимическая активность: крайне низкая – разлагают только глюкозу, продуцируют каталазу и цитохромоксидазу, протеолитическая активность отсутствует, H2S, аммиака, индола не образует.

Антигенная структура: Содержит А и К антигены, ЛПС обладают сильной иммуногенностью, основную антигенную нагрузку несут пили и белки мембраны. Наружная мембрана содержит протеины I, II, III классов, проявляющих сильные иммуногеннные свойства

Факторы патогенности: капсула, пили, эндотоксин, белки мембраны

Капсула обладает антифагоцитарным действием. Пили обеспечивают адгезию к эпителию. Клеточная стенка содержит эндотоксин. Поверхностный белок I класса – обеспечивает устойчивость к бактерицидным факторам слизистых оболочек. Класса II – (протеины мутности, ОРА-протеины) обуславливают прикрепление к эпителию, препятствуют фагоцитозу. N. синтезируют IgA протеазу, расщепляющую Ig.

Резистентность: очень неустойчивы в окружающей среде, чувствительны к действию антисептиков, высокочувствительны к пенициллинам, тетрациклину, стрептомицину. Способны к утилизации пенициллинов при приобретении бета-лактамаз.

Патогенез: Входные ворота – цилиндрический эпителий мочеполовых путей. Гонококки прикрепляются к эпителию посредством поверхностных белков, вызывают гибель и слущивание клеток, захватываются клетками, где размножаются, попадают на БМ, после чего попадают на соед. ткань и вызывают воспаление или попадают в кровь с возможным дессиминированием.

Иммунитет – почти отсутствует.

Микробиологическая диагностика:

Бактериоскопическое исследование: Материалом для исследования служит гнойное отделяемое из уретры, влагалища, примой кишки, глотки, сыворотки крови. Готовят мазки, окраска по Граму, При «+» результате – обнаруживают гонококки – грам+ диплококки бобовидной формы., находятся внутри лейкоцитов. Положительный диагноз ставится при острой форме гонореи до применения антибиотиков.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри со специальными питательными средами — КДС, сывороточным агаром. Среда КДС содержит питательный агар с добавлением в определенной концентрации казеина, дрож­жевого экстракта и сыворотки крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24—72 ч. Гонококки образуют круглые прозрач­ные колонии, напоминающие капли росы, в отличие от более мутных колоний стрептококков или пигментированных колоний стафилококков, которые также могут расти на этих средах. Подо­зрительные колонии пересевают в пробирки на соответствующие среды для получения чистых культур, которые идентифицируют по сахаролитическим свойствам на средах «пестрого» ряда (по­лужидкий агар с сывороткой и углеводом). Гонококк ферментирует только глюкозу с образованием ки­слоты..

Серодиагностика. В некоторых случаях ставят РСК Борде — Жангу. В качестве антигена используют взвесь убитых гонокок­ков. Реакция Борде—Жангу имеет вспомогательное значение при диагностике гонореи. Она положительна при хронической и осложненной гонорее.

Лечение: антибиотикотерапия (пенициллин, тетрациклин, канамицин), иммунотерапия - Гонококковая вакцина - взвесь гонококков, убитых нагреванием, используется для вакцинотерапии хронической гонореи.