29. Определение концентрации спермиев в сперме при помощи приборов (камера Горяева, фэк, оптический стандарт).

Концентрация спермиев – это степень насыщенности спермы половыми клетками, которая выражается количеством спермиев в 1 мл спермы.

Определение густоты спермы путем глазомерной оценки не дает полного представления о количестве спермиев в эякуляте, кроме того, при определении густоты возможны большие ошибки. Знание концентрации спермиев необходимо, чтобы точно рассчитать, во сколько раз можно разбавить свежеполученную сперму и сколько самок можно осеменить одним эякулятом.

Устройство и подготовка счетной камеры. Глубина камеры 0,1 мм, в одной сетке 25 больших квадратов по 5 в ряду, каждый разделен добавочными линиями на 16 малых квадратиков. Общая площадь сетки равна 9 мм2.

Все детали камеры перед сборкой следует обработать спиртовым тампоном и протереть марлевой салфеткой. Покровное стекло необходимо приложить к камере, прижать края стекла к боковым бровкам до появления радужных колец Ньютона. После фиксации стекла камера готова к заправке разбавленной спермой.

Разбавление спермы в смесителе. Разбавление спермы производят в специальном смесителе (меланжере) – стеклянной пипетке с пузырьковидным расширителем или пробирке с использованием 3% раствора натрия хлорида, обеспечивающего гибель половых клеток, следовательно, их неподвижность и возможность проведения подсчета.

Зарядка счетной камеры разбавленной спермой производится сразу же после перемешивания, если это сделать позже, то спермии начнут оседать, что приводит к грубым ошибкам при определении концентрации.

Первые четыре капли, не содержащие спермиев, из пипетки смесителя удаляют.

Методика подсчета. Спермии подсчитывают в 80 малых квадратиках, расположенных в 5 больших по диагонали.

Подсчет ведется по принципу буквы Г, так как другие стороны квадрата подсчитываются при возвращении. В малом квадратике подсчитываются все спермии, головки которых расположены В просвете квадратика и на его верхней и левой боковой гранях.

В соседнем квадратике используется тот же принцип, что исключает возможность повторного учёта одних и тех же спермиев и гарантирует точность исследования.

Для получения более точных результатов в камере Горяева рекомендуют считать спермиев в двух сетках и при вычислении концентрации брать среднее из 2-х подсчетов (разница будет не больше 10%, если считать в трех сетках и брать два более подходящих результата).

После окончания работы счетные камеры и стекла промывают вначале простой, а потом дистиллированной водой, и насухо вытирают марлевой салфеткой. Из смесителя удаляют остатки спермы и сразу же промывают их дистиллированной водой, затем спирт-эфиром. Высушивают смесители продуванием воздуха при помощи резиновой груши.

Определение концентрации спермиев в счетных камерах требует много времени. Поэтому на племпредприятиях используют специальные приборы.

Результаты исследований могут указывать на наличие патологических процессов, существенно влияющих на концентрацию спермиев в сперме. Так, если концентрация спермы окажется меньше физиологической нормы, то говорят об олигоспермии, если при подсчете не удалось обнаружить спермиев – аспермия.

Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М. Этот метод основан на способности мутных жидкостей со взвешенными частицами поглощать свет прямо пропорционально числу этих частиц.

Степень поглощения пропускаемого через исследуемую жидкость светового пучка определяется в фотоэлектроколориметре (ФЭК). При определении концентрации на ФЭК сначала строят калибровочную кривую. Для этого берут пробы спермы с различной концентрацией спермиев и устанавливают в ФЭК их оптическую плотность, по которой в дальнейшем судят о

концентрации спермиев в исследуемых пробах. Построенную градуированную кривую следует ежемесячно проверять, так как показания прибора могут изменяться из-за старения фотоэлемента и лампы накаливания.

Сходен по принципу с ФЭК и метод определения концентрации спермиев при помощи фотоэлектрического эритрогемометра. Фотоэлектрические методы позволяют быстро (за 2—3 мин) определить копает рацию спермы. Однако эти приборы созданы для анализа истинных растворов, а сперма является взвесью спермиев ней имеется меньшее и большее количество эпителиальных клеток, результат может быть неточным. Поэтому продолжаются поиски более точных и быстрых методов определения концентрации спермы.

Предложены весовой и объемный методы определения концентрации спермиев по измерению осадка после центрифугирования спермы (Братанов, Болгария); погрешность не более 10%.

По величине электрического сопротивления. Было замечено, что величина электрического сопротивления зависит от подвижности и концентрации спермиев.

Быстрый (37—40 с) и точный метод подсчета числа спермиев в сперме на скоростном автоматическом счетчике клеток — целлоскопе разработан М. П. Рязанцевым. Дли этого можно использовать и венгерский прибор «Пикоскель».

Определение концентрации спермиев при помощи оптического стандарта

В пустую пробирку вносят 1,0 мл 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Конец пипетки вытирают снаружи салфеткой, а затем два раза промыва-ют ее раствором в пробирке. Пробирку слегка встряхивают и держат рядом со стандартом. Стандарт предварительно должен быть хорошо взболтан. К пробиркам сзади вплотную прикладывают лист с печатным текстом.

К исследуемой сперме добавляют пипеткой 1%-ный раствор натрия хлорида в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом. Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и стандар-та совпадут, проводят расчет по формуле:

К = 50 (n + 0,1),

где: К – концентрация спермы (млн./мл);

n – объем внесенного 1%-ного раствора натрия хлорида (мл);

50 – коэффициент.

Оптический стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн./мл.

Пример: Для выравнивания оптической плотности до стандарта к ис-следуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом ранее налитого в пустую пробирку).

К = 50 х (4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 (млн./мл)

Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн. спермиев.