6. Исследование лекарственных средств, не стерилизуемых в процессе производства: какие показатели определяются?

В отношении ЛС, не стерилизуемых в процессе производства, проводится испытание на микробиологическую чистоту. Это испытание вкл. в себя количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определённых видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных ЛС.

Испытание проводят в асептических условиях. ЛС, обладающие антимикробным действием, и консерванты, входящие в состав некоторых ЛС, могут подавлять рост отдельных видов микроорганизмов при проведении испытаний. Во избежание неправильной оценки результатов испытания определяют действие ЛС в отношении тест-микробов. Для испытания антимикробного действия ЛС, не стерилизуемого в процессе производства, применяют тест-микробы: B. subtilis, B. cereus, E. coli, S. aureus, Salmonella abony, Candida albicans, Aspergillus. Предварительно готовят разведения ЛС: 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000. В пробирки с питательными средами вносят по 1 мл каждого разведения, в контрольные пробирки - по 1 мл стерильной дистиллированной воды. Затем во все пробирки вносят по 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма. При обнаружении антимикробного действия ЛС устраняют его и после этого производят посев на микробиологическую чистоту. При отсутствии антимикробного действия производят прямой посев.

Количественное определение бактерий и грибов проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри.

7. Методика определения общего количества бактерий, общего количества грибов.

Определение общего числа бактерий. Испытуемый раствор вносят по 1 мл в каждую из 2х пробирок с 4 мл расплавленного и охлажденного до 40-45 С МПА. Быстро перемешивают содержимое каждой пробирки и переносят в чашки Петри, содержащую 15-20 мл застывшего агара. Быстрым, осторожным покачиванием чашки равномерно распределяют верхний слой агара.

После застывания среды чашки Петри переворачивают и инкубируют в течение 5 суток при 30-35 градусах. Через 48 часов и окончательно через 5 суток подсчитывают количество бактериальных колоний на 2 чашках, вычисляют среднее значение и т.о. находят число бактерий в 1 мл образца. Определение общего числа грибов. Испытание проводят двухслойным агаровым методом, используя плотную среду Сабуро. Инкубируют посевы при 20-25 градусах. Через 72 ч и окончательно через 5 суток подсчитывают общее количество колоний дрожжевых и плесневых грибов на 2 чашках, находят среднее значение.

Выявление и идентификация видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных ЛС: бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

8. Наличие, каких микробов не допускается в лекарственных средствах? Методика их выявления и идентификации.

бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

Выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae. Образец испытуемого ЛП в количестве 10 мл вносят в 100 мл лактозного бульона, перемешивают и инкубируют при 30-35ºС в течение 2-5 часов. Затем из этой смеси 10 мл переносят в 100 мл среды обогащения. Оставшуюся смесь в лактозном бульоне оставляют в холодильнике. Посев в среде обогащения инкубируют при 30-35ºС в течение 18-24 часов. При отсутствии роста считают, что в препарате не содержатся бактерии семейства Enterobacteriaceae. При наличии роста исследование продолжают. Определяют следующие показатели: а) наличие видов Salmonella; б) наличие Escherichia coli; в) количество энтеробактерий (кроме Salmonella и Escherichia coli). Испытание на виды Salmonella проводят путём высевания из среды обогащения на чашки с висмут-сульфит агаром. На этой среде Salmonella образуют чёрные колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в чёрный цвет. Подозрительные колонии микроскопируют, отсевают на среду Олькеницкого и ставят тест на цитохромоксидазу. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что ЛС контаминировано (заражено) бактериями рода Salmonella. Испытание на Escherichia coli проводят путём высева из среды обогащения на чашку со средой Эндо. Подозрительные колонии красного цвета микроскопируют и при наличии грамотрицательных палочек делают пересев в пробирке с цитратным агаром Симмонса, на котором определяют утилизацию цитрата натрия по изменению цвета среды с зелёного на синий. Наличие индола определяют путём посева в питательный бульон. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что ЛС контаминировано Escherichia coli.

Количественное определение энтеробактерий (кроме Salmonella и Escherichia coli). Смесь в лактозном бульоне (из холодильника) в объёме 10 мл, 1 и 0,1 мл (что соответствует 1,0 и 0,1 г и 0,01 г препарата) засевают в среду обогащения, инкубируют при 30-35ºС в течение 18-24 ч. В случае роста делают пересев на чашку со средой Эндо и по появлению типичных колоний грамотрицательных бактерий устанавливают наличие энтеробактерий в определённом объёме препарата. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Образец в количестве 10 мл вносят в 100 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 30-35ºС в течение 24-48 часов. При наличии роста пересевают на чашку со средой для выявления пиоцианина и на чашку среды с маннитом. После инкубации в термостате отбирают подозрительные колонии. Идентифицируют Pseudomonas aeruginosa по морфологии (грамотрицательные неспорообразующие палочки), по специфическому запаху и сине-зелёному пигменту, наличию фермента цитохромоксидазы. Staphylococcus aureus идентифицируют по морфологии (грамположительные кокки), по сбраживанию маннита в анаэробных условиях, по реакции плазмокоагуляции.