4) Определение капсул

Метод Бурри-Гинса

Техника. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На чер­ном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы.

Мазок, окрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, ме­тиловым спиртом или на пламени. После промывания водой кра­сят 5-10 мин карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают.

Микроскопическая картина. Бактерии фиолетовые или крас­ные. Фон черный. Капсулы неокрашенные

Способ Михина

Техника. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим Леффлера в течение 2-3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина. Капсулы – светло-розовые, бактерии – темно-синие.

Способ Ольта

Техника. Мазок окрашивают 2-3 % водным раствором сафранина в течение 1-3 минут с последующим быстрым смыва­нием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости.

Микроскопическая картина: капсулы – бледно-желтого, а бактерии – коричневого цвета.

Способ Кауфмана

Техника. Мазок окрашивают метиленовым синим Леффлера в течение 2-3 минут. Краску смывают водой и мазок погру­жают в 0,25% водный раствор протаргола или 0,5% раствор азотнокислого серебра на 3-4 минуты, затем окрашивают кар­боловым раствором фуксина, разведенным 1:20, в течение 5-10 секунд, промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы – темно-красные, бак­терии – темно-синие.

8. Как производится окраска по Граму в модификации Синёва? Сущность окраски по Граму в модификации Синёва: в какой цвет окрашиваются грамположительные бактерии? Почему?

Техника окраска по Граму в модификации Синёва.

1. На фиксированный препарат наносят 2-3 капли воды и кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной краской генцианвиолет. Окрашивают 1-2 минуты.

2. Снимают бумажку, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и наливают на препарат спирт с йодом на 30 секунд. Промывают водой.

4. После этого окрашивают мазок водным фуксином в течение 1 минуты.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют. В результате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Это явление связано с тем, что у грамположительных бактерий после обработки раствором Люголя образуется комплекс иода с генциановым фиолетовым, который не может экстрагироваться из клетки, в то время как у грамотрицательных он легко удаляется при промывании бактерий этанолом, а затем водой.

9. В какой цвет окрашиваются грамотрицательные бактерии? Почему? От чего зависит различное отношение бактерий к окраске по Граму?

при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, который окрашивает все грамотрицательные бактерии в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки.

Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Успех окраски зависит от ряда причин и, прежде всего, от правильности обработки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окраски фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

10. Отношение бактерий к окраске по Граму в модификации Синёва: кокков, спорообразующих палочек, неспорообразующих палочек, извитых форм (перечислить исключения из правил).

Кокки окрашиваются по Граму положительно, за исключением гонококков и менингококков. Палочки, не образующие спор, грамотрицательны, за исключением палочек дифтерии, туберкулёза и проказы. Палочки, образующие споры (бациллы и клостридии), - грамположительны. Извитые формы (вибрионы и спириллы) грамотрицательны.

11. Техника окраски по Цилю-Нильсену. Принцип окраски: в какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии, в какой – кислотоподатливые и почему? Какова основная особенность клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий?

Метод окраски по Цилю — Нильсену (по Цилю — Нельсену) — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта. Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля и патологоанатома Фридриха Нельсена (Нильсена), которые разработали его в 1882—1883 гг.

При окраске по этому методу кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий (представители семейства Mycobacteriaceae ) представлена тонким слоем пептидогликана , с которым ковалентно связан слой полисахарида арабиногалактана * .

К последнему ковалентно присоединены миколовые кислоты * – необычные высокомолекулярные (60-90 атомов углерода) разветвленные жирные кислоты, покрывающие всю поверхность клеточной стенки сплошным гидрофобным слоем. Гликолипиды сложного состава, нековалентно связанные с миколовыми кислотами , образуют второй липидный слой клеточной стенки.

В результате формируется атипичная мембраноподобная структура , имеющая значительную толщину (более 10 нм) и очень высокую вязкость / низкую текучесть. Эта структура отличается повышенной стабильностью и крайне низкой проницаемостью. Липидный бислой клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий пронизан белками, сходными с поринами наружной мембраны клеточной стенки грациликутных бактерий. Эти пориноподобные белки образуют каналы малого диаметра, обеспечивающие диффузию мелких гидрофильных молекул. Слабо разветвленные полимерные молекулы полисахарида арабиноманнана, ковалентно связанные с липидами ЦПМ, формируют липоарабиноманнан (ЛАМ), пронизывающий клеточную стенку и выступающий над ее поверхностью. Белки/липопротеины клеточной стенки располагаются преимущественно на ее поверхности.