6. Для чего нужны сложные методы окраски? Назовите методы окраски, позволяющие дифференцировать бактерии на две группы по структуре клеточной стенки;

Сложные методы окраски позволяют отличить одну группу бактерий от другой или выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Другими словами: при сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

Окраска методом Грама позволяет дифференцировать бактерии с разным строением клеточной стенки.Все микробы по отношению к окраске методом Грама делятся на две группы: а) грампозитивные или грамположительные; б) грамнегативные или грамотрицательные.

7. Назовите методы окраски, позволяющие выявлять кислотоустойчивые микробы; выявлять споры; выявлять зёрна волютина; выявлять капсулы.

1)Кислотоустойчивые бактерии по ЦилюНильсену: метод окраски

Несмотря на свое название, кислотоустойчивые бактерии предпочитают расти на нейтральных средах. Их устойчивость к перепадам кислотности внешней среды обусловлена особым строением клеточной стенки и составом клеточного содержимого.

Окраска таких бактерий карболовым фуксином в красный цвет является очень стойкой – в результате кислотоустойчивые микроорганизмы не обесцвечиваются после обработки их раствором серной кислоты.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые – в синий

В данную группу входят различные таксоны – микобактерии, актиномицеты, бактерии, способные к азотфиксации. Таксономия выделяет их в отдельную межвидовую группу. Повышенной кислотоустойчивостью отличаются также споры ряда бактерий – спящие формы, окруженные плотной оболочкой и имеющие повышенную устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды. Процесс образования спор занимает у бактериальной колонии 18-20 часов, а просыпаются они при наступлении благоприятных условий за 4-5 часов.

Кислотоустойчивые формы бактерий считаются грамположительными, поскольку таксономия этих организмов основана на толщине их стенок, которую демонстрирует окраска по Граму.

Окраска по методу Циль-Нильсена

1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и промывают мазок водой.

2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в тече­ние 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.

3. Мазок тщательно промывают водой.

4. Споласкивают 96°спиртом.

5. Снова промывают водой.

6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором (1:1000) малахитовой зе­лени или метиловой зелени.

7. Краску смывают водой, препарат высу­шивают.

2) Выявление спор

Форма, величина и расположение спор постоянны для каждого вида бацилл. В отличие от вегетативной части клетки, споры содержат значительно меньше свободной воды и большое количество липидов и кальция. Плотная оболочка спор, непроницаемая для воды, окрашивается с большим трудом, поэтому при обычных методах окраски споры имеют вид неокрашенных пустот внутри клетки. Для окраски спор пользуются специальными методами с применением протрав (кислоты или щелочи). Протравы разрыхляют оболочку споры, облегчая проникновение в нее красителя. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью, в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков: препарат окрашивают основным красителем, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в какой-нибудь контрастный цвет.

а) Окраска спор методом Ожешко:

• На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты (НСl) и подогревают 1-2 мин над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

• Остывший препарат промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки.

• Окрашивают карболовым фуксином Циля с подогреванием до появления паров.

• Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.

• Промывают водой.

• Докрашивают метиленовым синим Леффлера или 1% водным раствором малахитового зеленого 3-5 мин.

Окрашенные споры имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток приобретают цвет дополнительного красителя — голубой при применении метиленового синего или зеленый при использовании малахитового зеленого.

б) Окраска спор методом Пешкова:

• На фиксированный мазок наливают метиленовый синий Леффлера, дают краске закипеть. Окрашивание мазка кипящим красителем производится в течение 20-30 с.

• Препарат промывают водой.

• Докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного в течение 30-60 с.

• Промывают водой и высушивают.

Споры, окрашенные метиленовым синимЛеффлера, имеют голубой цвет, вегетативные тела бактерий — красный.

в) Окраска спор методом Дорнера:

• Исследуемый мазок высушивают на воздухе.

• Фиксируют над пламенем горелки.

• Покрывают кусочком фильтровальной бумаги, пропитанной карболовым фуксином Циля, поддерживая влажное состояние фильтровальной бумаги добавлением красителя. Мазок подогревают над пламенем горелки 10 мин или помещают стекла на штатив, расположенный над емкостью с кипящей водой.

• Удаляют фильтровальную бумагу и наносят на мазок смесь Никифорова на 1 мин.

• Мазок промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой.

• На предметное стекло с мазком наносят насыщенный раствор нигрозина (рецепт 31).

После окраски вегетативные тела остаются бесцветными, а споры приобретают красный цвет. Микробные тела находятся на черном фоне.

3)Определение волютина

А)Окраска по методу Нейссера для выявления зерен волютина

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 1 – 2 мин. синькой Нейссера.

2. Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин.

3. Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.

4. Докрашивают в течение 2 мин. раствором хризоидина или 1 – 3 мин. раствором везувина.

5. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, тела микробных клеток – в светло-коричневый цвет.

 ( Волютин - один из типов включений. Непостоянно присутствует у коринебактерий, спирилл, дрожжей. Представляет собой запасной питательный материал в виде комплексов РНК с метаполифосфатами. Выявление В. применяют для идентификации коринебактерий дифтерии, у к-рых В. располагается в виде зерен по концам бактерий. Обнаруживают В. окраской по Нейссеру или Леффлеру )

Б)Окраска зерен волютина методом Раскиной:

• На мазок, высушенный на воздухе, предварительно не фиксированный, наливают красящую смесь Раскиной.

• Предметное стекло с препаратом нагревают на пламени горелки до полного сгорания спирта.

• Препарат промывают водой.

• Высушивают и микроскопируют.

Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина — в темновишневый.

Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностиче­ское значение. Бактериальные капсулы представляют собой слизистый слой, состоящий из разбухших в воде в виде геля полисахаридов или полипептидов.

В мазках из органов или из тканей капсулы можно обнаружить при помощи простой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты.

Для их выявления в мазке можно использовать негативные методы окраски, при которых окрашивают фон препарата и клетки, окруженные бесцветными капсулами.