-
Общая характеристика векторов для экспрессии чужеродных белков в e. Coli.
-
Регуляция экспрессии лактозного оперона.
Оперон – это единица координированной транскрипции генов прокариот. В лактозном опероне E. Coli закодировано несколько ферментов, участвующих в метаболизме бактерии, а конкретно в усвоении лактозы (в клетке E. Coli лактоза расщепляется на глюкозу и галактозу). Чтобы лучше понять регуляцию экспрессии оперона, нам необходимо рассмотреть его строение:
-
Лактозный оперон E. Coli это участок ее генома, в котором есть промотор и терминатор для начала и конца синтеза маточной РНК соответственно.
-
Внутри оперона находятся три структурных гена lacZ, lacY и laсA, кодирующих β-галактозидазу, β-галактозидперпермеазу, β-галактозидтрансацетилазу.
-
Сразу после промотора находится оператор (участок связывания с белком репрессором)
-
Перед лактозным опероном находится еще один один оперон, состоящий из промотора, гена lacI, кодирующего белок-репрессор и терминатора.
Рисунок 2.1 Строение лактозного оперона
Негативная регуляция. При отсутствии или низкой концентрации лактозы в клетке, белок-репрессор связывается с оператором и препятствует транскрипции. В отсутствие лактозы в клетке ферменты расщепления лактозы не вырабатывются. При попадании лактозы в клетку, ее молекулы связываются с белком-репрессором, что приводит к изменению его конформации и диссоциации от оператора. Транскрипция генов лактозного оперона становится возможной, оперон активирован. При снижении концентрации лактозы в клетке, новые порции белка-репрессора связываются с оператором и блокируют синтез ферментов.
Позитивная регуляция: если в клетке концентрация глюкозы достаточно высока для поддержания метаболизма, активация лактозного оперона не происходит, так как отсутствсия белка-репрессора недостаточно для начала транскрипции. Однако, если концентрация глюкозы снижается, происходит активация фермента аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в циклическую форму – цАМФ (cAMP). Происходит связывание цАМФ с белком, активирующим катаболизм (CAP) и образуется комплекс сAMP-CAP, взаимодействующий с промотором лактозного оперона и изменяющим его конформацию, что приводит к увеличению сродства РНК-полимеразы к промотору. Происходит экспрессия генов.
-
Современные способы получения инсулина.
В настоящее время используются два способа промышленного производства препаратов для диабетиков:
— ферментативная обработка свиного инсулина,
— генно-инженерный.
Гормон у свиней отличается от человеческого всего на одну аминокислоту – вместо треонина присутствует аланин. Поэтому чтобы придать ему структуру человеческого, производят химическую модификацию животного сырья. В процессе химической реакции отщепляют аланин и присоединяют треонин.
При генно-инженерном способе для выпуска средства используются генетически измененные микроорганизмы (бактерии, дрожжи). Имеются два варианта производства подобного инсулина.
Первый вариант предполагает применение двух штаммов какого-то микроорганизма. Каждый из штаммов синтезирует одну цепь молекулы ДНК. Потом две цепи соединяются, после чего из раствора выделяются активные формы инсулина.
Суть второго варианта состоит в том, что микроорганизм сначала производит проинсулин. После обработки ферментами проинсулин превращается в активный гормон.
В инсулиновых препаратах, если они не прошли надлежащую очистку, могут присутствовать различные примеси, способные вызывать нежелательные побочные эффекты.
К таким примесям относятся проинсулин, белки, глюкагон и т.д. Современные технологии очистки, при их соблюдении, позволяют производить очищенные (монопиковые) и высокоочищенные (монокомпонентные, кристаллизованные) инсулины.
-
Стратегия очистки белков. Выбор методов разделения для очистки белков. Типичная схема очистки белка. Основные параметры (выход, степень очистки), характеризующие процесс очистки. Представление хода очистки белка.
-
Обращенно-фазовая и гидрофобная хроматография белков.
-
Ионообменная хроматография белков.
-
Гельпроникающая хроматография белков.
-
Аффинная хроматография белков.
-
Электрофорез белков. Изоэлектрофокусирование.
-
Электрофорез белков Электрофорез с использованием додецилсульфата натрия.
-
Принципиальное устройство ферментера.
-
Плазмида pBR322, строение, свойства, принцип использования.
-
Плазмида pET, строение, свойства, принцип использования.
-
Плазмида pUC19, строение, свойства, принцип использования.
-
Принцип использования металлохелатной аффинной (HisTag) хроматографии для выделения рекомбинантных белков.