12. Методы сайт-направленного мутагенеза с использованием пцр.

Этот принцип основан на том, что мы можем использовать не комплементарные праймеры. Если мы исползуем праймеры в которых один или несколько олигонуклеотидов не комплементарны нашей матричной цепи, то в каждой молекуле вновь синтезированной ДНК оказывается эта мутация. Нужно лишь позаботится о том, что бы этот праймер имел достаточное сродство к матрице и ПЦР шла селективно. Могут быть разные варинты модификации:

-Либо отличающийся олигонуклеотид внутри прймера, как на слайде

-Либо висячий хвот, как справа на слайде.

Нам обычно нужно модифицировать некий участок внутри молекулы ДНК, используя праймер мы вносим модификацию на один из концов молекулы ДНК. Хоть сейчас праймеры могут быть достаточно большими, но протяженность тех молекул куда нам нужно вносить модификации гораздо больше, поэтому приходится находить какие-то новые методы.

2 метода:

Мегапраймерная схема.

Есть участок ДНК, который мы собираемся модифицировать.

Мы должны выбрать рядом с этой мутацией сайты рестрикции (R1 и R2 на слайде) (по которым потом мы будем переносить модифицированный фрагмент ДНК обратно)

Дальше мы выбираем один из праймеров (с одним праймером нам трудно что-то сделать, тк это праймер к тому месту куда мы ходим внести модификацию [кружок это и есть не комплементарный участок ДНК, где потом в модифицированной цепи будет мутация]), а второй праймер мы выбираем так, чтобы он находился за сайтом рестрикции R2 , чтобы потом полученный амплифицированный фрагмент ДНК содержал этот сайт рестрикции R2.

Затем проводится ПЦР1, получаем модифицированный фрагмент, в котором с одной стороны есть сайт рестрикции, а с другой стороны соответствующая мутация.

Теперь что бы этот фрагмент перенести обратно в цепь ДНК, нам нужно его достроить. Можно использовать подход, который заключается в применении именно этого фрагмента, как мегапраймера. То есть снова берем изначальную цепь ДНК, теперь уже берем мегапраймер с одной стороны, и с другой стороны берем праймер так, чтобы он снова находился за сайтом рестрикции R1­. (вторая цепь работать не будет, потому что не будет амплификации. Амплификация в ПЦР проходит только тогда, когда есть 2 праймера, которые фланкируют область, которую мы амплифицируем и именно это приводит к экспоненциальному росту количества ДНК. В случае же если праймер один, то после ПЦР получается всего одна молекула)

После ПЦР2 у нас получилась одна молекула, но она содержит мутацию и фланкированную двумя сайтами рестрикции, по которым мы можем вернуть необходимый фрагмент ДНК в исходную молекулу.

Этот метод часто используется, но мегапраймер не всегда эффективно работает и сейчас наибольшее распространение получил второй метод.

ПЦР с достройкой перекрывания (overlap extension PCR)

Начинается все так же, мы хотим ввести мутацию, значит мы должны выбрать сайты рестрикции (R1 и R2 на слайде), мы делаем первые 2 праймера, (все тоже самое) один с мутацией, другой стоит после R2, происходит ПЦР1 и образуется новый фрагмент.

Тоже самое делаем с другой стороны, чтобы получить фрагмент, содержащий R1.

Смысл в том, что полученные фрагменты в ПЦР1 и ПЦР2 должны перекрываться. И эти участки, содержащие мутацию в обоих случая полностью идентичные.

После этого полученные фрагменты денатурируются и отжигаются. Получается, что эти две одиночные цепи будут взаимодействовать.(стрелочки показывают , что это одноцепочечные молекулы ДНК). И после этого от 3` конца идет достраивание цепи по второй с помощью ПЦР. (в две стороны и снизу, и сверху). Получаем полную цепь содержащую мутацию и фланкированную двумя сайтами рестрикции.

После этого мы добавляем 2 праймера, до R1 и после R2 , и производим амплификацию.

Оба метода широко используются и позволяют получать модифицированные ДНК очень эффективно.

13. Методы трансформации E. coli (использование протопластов, Са++-зависимый метод, использование положительно-заряженных полимеров и липосом, электропорация, упаковка ДНК в капсид фага  in vitro).

14. Создание и скрининг генетических библиотек.

15. Конструирование векторов для клонирования на основе плазмид. Векторы, позволяющие проводить прямой отбор гибридных молекул ДНК.

16. Конструирование векторов для клонирования на основе фага .

17. Клонирование в космидах, фазмидах.

Векторы на основе фага лямбда. ДНК фага лямбда - это линейная двухцепочечная молекула размером около п.о. с одноцепочечными 5-концами из 12 нуклеотидов. Их называют cos- концами (cos-сайтами), они взаимокомплементарны и могут спариваться друг с другом с образованием кольцевой молекулы. В зрелых вирионах ДНК находится в форме линейной молекулы, попадая в клетку, ДНК циклизуется по соs-сайтам и функционирует в кольцевой форме. Преимущество использования фага лямбда перед плазмидами в том, что можно клонировать до 20 кб чужеродной ДНК. Эффективность внедрения рекомбинантных фагов составляет 100% в отличие от трансформации, при которой эффективность внедрения ДНК составляет

КОСМИДА = COS-САЙТ + ПЛАЗМИДА

Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага λ (Cos-сайт), обеспечивающий упаковку этой ДНК в фаговую частицу.

Космиды могут амплифицироваться как плазмидный вектор в клетках E. coli и быть нагруженными до 40 кб чужеродной ДНК. В космидный вектор можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК (40 кб) по сравнению с плазмидным или фаговым вектором, поскольку собственная ДНК космидного вектора мала, около 10 кб и способна эффективно доставлять рекомбинантную ДНК с помощью фага лямбда. По этой причине космиды используют при клонировании геномной ДНК эукариот

Рисунок 1 -картинка из лекции. не очень понятная, ниже поннятнее на мой взгляд

С помощью космид можно клонировать участки ДНК размером 32-47 т.п.н. Для этого космиду и чужеродную ДНК обрабатывают одной и той же эндонуклеазой рестрикции, после чего полученные линейные фрагменты смешивают и проводят реакцию лигирования. Далее происходит упаковка ДНК в фаговые головки in vitro, она разрезается в cos-участках. Необходимые вирусные белки получают из лизата E.coli cI857 (red- gam- Sam и Dam (головка) и Eam (хвост)). Этот процесс сопровождается селекцией фрагментов по размеру, поскольку упаковываться может только ДНК длиной 78-105 % от генома фага лямбда. Таким образом в вирионы попадут преимущественно рекомбинантные космиды, содержащих клонированный участок ДНК. Продукты лигирования между двумя космидами будут слишком малы для упаковки, а между двумя фрагментами чужеродной ДНК — велики.

Полученные фаговые частицы с рекомбинантными космидами используют для инфицирования клеток кишечной палочки. В цитоплазме космиды циклизуются благодаря соединению липких концов и действию фермента лигазы, а далее реплицируются как обычные плазмиды, не проявляя никаких свойств фага лямбда. Селекция трансформированных клеток проводится по маркерным геном, присутствующим в векторной молекуле.

ФАЗМИДА = ФАГ + ПЛАЗМИДА

Фазмиды (фагмиды) – это векторы, являющиеся гибридом между фагом и плазмидой и способные после встраивания чужеродной ДНК существовать и как фаг, и как плазмида.

Фазмиды после встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, а в других как плазмиды. Исходно фазмида имеет размер до 30 кб. В ее состав входит до 70% генома фага, включая coscайты и ori- последовательность фага. Применение фазмидных векторов значительно упрощает процедуру получения и отбора рекомбинантных векторов, поскольку только рекомбинантные фазмиды образуют на бактериальном газоне фаговые бляшки. В отличие от космидной или фаговой векторных систем, фазмидный вектор существует в клетке в виде плазмиды, а клонотека хранится в виде суспензии гибридных фагов

Размер λpMYF131 таков, что она не может эффективно упаковываться в фаговые частицы. Упаковка становится возможной после встройки чужеродной ДНК. Размер клонируемого фрагмента около 15 тпн.

Для поддержания фазмиды в клетках в виде плазмиды используют штаммы E. Coli лизогенные по фагу λ. Такие штаммы продуцируют фаговый белок-репрессор cI, подавляющий развитие фага по литическому пути. Для перевода фазмиды в фаговую форму меняют условия культивирования (например, повышают температуру) или используют другой штамм.