3 курс / Фармакология / Диссертация_Куркин_Д_В_Противодиабетические_свойства_и_некоторые

91

дегидрогеназ, приобретает малиновую окраску [Brait V. H., 2010]. Для этого изготавливались срезы больших полушарий толщиной 2 мм, которые затем инкубировались в 0,2% растворе 2,3,5,-трифенилтетразолия хлорида при 37ºС в течение 20 минут. После окрашивания срезы фотографировались в одной плоскости с миллиметровой линейкой. При помощи программного обеспечения

ImageJ определяли площадь окрашенной и неокрашенной ткани. Для избегания возможного завышения размера некроза вследствие отека, учитывался скорректированный объем зоны инфаркта (ЗИ), который рассчитывался в процентах относительно объема интактной гемисферы по упрощенной формуле:

ЗИ = ((B – (A – C))/B)*100%, где A – суммарная площадь пораженных гемисфер на срезах (мм2), B – суммарная площадь интактных гемисфер на срезах (мм2), С

– суммарная площадь зон инфаркта на срезах (мм2).

2.17 Морфологические методы исследования‡

После эвтаназии животных (хлоралгидрат 800 мг/кг в/в) извлекали ткань поджелудочной железы и головной мозг. Парафиновые срезы ткани поджелудочной железы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым методикам [Снигур Г. Л., 2010, Sun G., 1997]. Для проведения иммуногистохимического исследования использовались мышиные моноклональные антитела к инсулину (клон 1G4, GeneTex) в разведении 1:100.

Для изучения апоптоза использовали первичные антитела против каспаза 3

(мышиные моноклональные антитела, клон 3F49, GeneTex) в разведении 1:50.

Для определения пролиферативной активности использовали первичные антитела к белку Ki-67 (кроличьи поликлональные антитела, LifeSpan BioSciences) в разведении 1:50. Данный вид исследования выполняется по стандартным протоколам в соответствии с инструкциями фирм производителей

‡ Выполнено совместно с сотрудниками кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО ВолгГМУ

за что выражаем искреннюю благодарность

92

реактивов. Для визуализации использовали полимерную систему EnVision

(Thermo Scientifi c, Fremont, CA); хромогендиамино-бензидин. Препараты докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью микроскопа Axiostar plus («Карл Цейс», Германия); объектив ×10, ×40, окуляр ×10, цифровая камера

Canon (Japan, 5.0 мегапикселей). Морфометрическое исследование проводили с помощью компьютерной программы «Видео Тест-Морфо-4» (Россия).

Определяли периметр панкреатических островков (L, мкм) и их площадь (S,

мкм2). Экспрессию инсулина оценивали путем определения абсолютной и относительной площади иммунореактивного материала (β-клеток). Оценка результатов иммуногистохимической реакции осуществлялась по интенсивности окраски с использованием полуколичественной шкалы

(негативная, слабая, умеренная, выраженная). Морфометрию тканей головного мозга проводили при окрашивании срезов по Нисслю.

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе

«Micros» (Austria) цифровой фотокамерой «Olympus» (Japan).

2.18 Острая токсичность

Острую токсичность при однократном введении изучали на мышах и крысах обоего пола массой 18–22 и 180-220 г соответственно. Соединение вводили животным внутрижелудочно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток,

отмечая клинику отравления и количество погибших животных.

2.19 Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов следующих программ: Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, США), Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США), Prism 6 (GraphPad

Software Inc., США). Для проверки распределения на нормальность

93

использовали критерий Шапиро-Уилка. В зависимости от характера данных использовали следующие методы статистического анализа: однофакторный дисперсионный анализ (One-Way ANOVA) либо ранговый однофакторный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с последующим применением апостериорных (post hoc) критериев (t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони либо критерия Данна). Статистически значимыми расценивались различия при p < 0,05 [Гланц С., 1999; Реброва О. Ю., 2006].

96

Первое вещество серии (Рисунок 8) при скринировании показало активность EC50 4 нМ. На этом этапе была произведена оценка его отдельных параметров ADME (absorption, distribution, metabolism and excretion –

параметры всасывания, распределения, метаболизма и выведения) с целью выявления возможных недостатков в фармакокинетических свойствах соединения [Singh S. S., 2006].

Растворимость была оценена в сравнении с рекомендуемыми стандартами. Результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4

Растворимость ZB-09 при различных pH

Первичное соединение (ZB-09) обладает крайне плохой растворимостью в воде во всем диапазоне значений pH, что существенно ограничивает его дальнейшее использование.

Следующим этапом было определение стабильности вещества в микросомах (человека, крысы и мыши) для оценки потенциальной скорости метаболизма вещества в печени, поскольку это важно с точки зрения времени полужизни в крови, максимально достижимой концентрации в крови,

частоты приема лекарственного средства и т.д. Данные по микросомной стабильности вещества ZB-09 представлены в табл.5.

Микросомы печени – субклеточная фракция, содержащая основные метаболические ферменты, такие как цитохромы Р450, флавин-

монооксигеназы, УДФ-глюкуронозил трансферазы, карбоксиэстеразы,

гидролазы и другие. Доступность микросом, получаемых из печени различных видов млекопитающих, делает их одним из широко используемых

97

средств для оценки метаболизма (предсказание возможных метаболитов,

идентификация цитохромов, отвечающих за метаболизм исследуемого препарата) новых химических соединений [Singh S. S., 2006].

Микросомальная устойчивость ZB-09 невысока и в случае микросом человека время полужизни (время падения концентрации вещества вдвое в присутствии микросом) составляло всего 4 минуты, что указывает на потенциально высокую метаболизируемость соединения под действием ферментов печени. Это может повлечь за собой укорочение периода полувыведения препарата и снижение его максимальной плазменной концентрации до уровня, недостаточного для развития терапевтического эффекта.

Таким образом, анализ первичных выборочных данных из панели

ADME указал на проблемные свойства соединения ZB-09 и помог сфокусировать работу над их улучшением путем модификации структуры.

Прежде всего, было необходимо повысить растворимость и микросомальную устойчивость веществ.

Анализ структуры соединения ZB-09 показывает, что оно содержит в себе третбутил-оксикарбонильную группу, которая, во-первых, обладает высокой липофильностью (сродством к неполярным растворителям, что обычно способствует снижению водорастворимости), и, во-вторых, эта группа считается метаболически неустойчивой (и химически малоустойчивой, особенно в кислой среде – ограничение перорального

98

приема). Таким образом, в структуру веществ данной серии требовалось внести следующие изменения: найти приемлемый биоизостерный заместитель для третбутил-оксикарбонильной группы и ввести в структуру радикалы, обладающие большей гидрофильностью.

Биоизостер третбутил-оксикарбонильной группы должен примерно соответствовать ей по размеру и по распределению в нем электронной плотности, а также по расположению полярных (способных к образованию водородных связей) и липофильных частей. Одним из простейших,

классических вариантов является попытка замены третбутил-

оксикарбонильной группы другими уретановыми фрагментами, например,

изопропил-оксикарбонильной группой. Исходя из этих предположений,

синтезировили структуру ZВ-17. Неклассический биоизостер третбутил-

оксикарбонильной группы – это гетероциклическая ароматическая структура,

где атомы азота в какой-то степени являются замещающими в место атомов кислорода оксикарбонила, а дополнительные заместители используются для модулирования липофильности. Таким образом, была синтезирована молекула под шифром ZВ-16 с хлорпиримидиновым заместителем у атома азота вместо уретанового. Также была предпринята попытка несколько изменить размер замещающей группы без изменения ее липофильности и полярности, что стало возможно благодаря замене третбутил-

оксикарбонильной группы на трифторэтильную. При этом дополнительные атомы фтора на алифатическом фрагменте играют двоякую роль – во-первых,

они модулируют липофильность (больше атомов фтора – выше липофильность), и, во-вторых, они, за счет своей электроотрицательности,

повышают электроакцепторный эффект заместителя, приближая

«электронное воздействие» алкильного заместителя к воздействию оксикарбонильного (т.е. азот в такой группе не приобретает ярко выраженного основного характера, как в случае просто алкильной группы).

Таким образом, была предложена структура ZВ-18.

99

Структуры и активности синтезированных аналогов ZВ-09 приведены в

табл.6.

Наличие в середине молекулы высоколипофильного фторфенильного структурного фрагмента вносит свой вклад в низкую растворимость конечного вещества в водных средах. Биоизостером фенила с несколько большей гидрофильностью, за счет потенциального образования водородных

100

связей по атому азота, может являться пиридин. В результате, был разработан дизайн вещества ZB-19, где в молекулу вместо фторфенила в средней части молекулы «встроен» пиридин. В структуре ZB-20 торцевая третбутил-оксикарбонильная группа замещена хлорпиримидином, что предположительно повысит стабильность в микросомах.

Аналитические данные показывают, что все синтезированные аналоги

ZВ-09 имеют высокую агонистическую активность в отношении GPR119.

При этом можно отметить, что замена третбутил-оксикарбонильной группой ее возможными биоизостерами не привела к существенному падению активности (за исключением некоторого снижения активности в случае трифторэтильной группы). Следующим этапом был анализ выборочных

ADME параметров для оценки влияния произведенных изменений структуры на целевые свойства молекул. Анализ растворимости в воде при разных значениях pH представлен в табл.7.

Данные по растворимости синтезированных соединений показывают,

что замена третбутил-оксикарбонильной группы на изопропил-

оксикарбонильную не приводит к улучшению растворимости в воде ни при одном из значений рН. Однако замена этой группы на трифторэтил и особенно на хлорпиримидин дает полученным соединениям повышение