1.2. Метод микродиффузии.

Во внешнюю камеру чашки Конвея вносят 1 мл крови и 1 мл 10% раствора серной кислоты. Во внутреннюю камеру помещают 2 мл 0,1% раствора хлорида палладия в 0,1н растворе соляной кислоты. Прибор плотно закрывают крышкой и оставляют на 1 час при комнатной температуре. При наличии СО в крови во внутренней камере появляется серебристая плёнка металлического палладия.

PdCI₃+ CO+ H₂O→Pd+CO₂ + 2 HCI

1.3. Спектроскопический метод

После разбавления крови дистиллированной водой до светло-розовой окраски её исследуют в спектроскопе. При рассмотрении крови наблюдаются линии и полосы поглощения между линиями Фраунгофера Д и E. Спектр оксигемоглобина имеет две полосы поглощения при длинах волн 577-589 и 536-556 нм, спектр карбоксигемоглобина ─две полосы при 564-579 и 523-536 нм.

После прибавления одного объёма свежеприготовленного раствора сульфида аммония или дитионита натрия к 4 объёмам водного раствора исследуемой крови оксигемоглобин превращается в дезоксигемоглобин, который имеет одну широкую полосу поглощения при 543-596 нм. Карбоксигемоглобин не восстанавливается сульфидом аммония и другими восстановителями. Поэтому после прибавления восстановителей полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают. Таким образом, после прибавления сульфида аммония к крови, содержащей окси- и карбоксигемоглобин, сохраняются две полосы поглощения карбоксигемоглобина, но исчезают полосы оксигемоглобина, а вместо них появляется широкая полоса поглощения дезоксигемоглобина. По наличию соответствующих полос поглощения делают вывод об отравлении оксидом углерода (II).

Спектральный метод оправдывает себя при исследовании крови, содержащей 10-30% карбоксигемоглобина.

Раздел 2.Количественное определение карбоксигемоглобина в крови

2.1.Спектрофотометрический метод

В химико-токсикологической практике применяется спектрометрический метод определения СО, разработанный В.Ф. Крамаренко, Б. А. Собчук и Т. Н. Гладышевской. Все соединения гемоглобина: Нb, НbСО, НbО можно обнару­жить по их спектрам поглощения. НbСО и НbО незначительно отличаются друг от друга. В связи с этим спектральные характеристики указанных соеди­нений трудно использовать для их количественного определения. Значитель­но отличаются друг от друга спектры поглощения Нb , НbСО. Поэтому разли­чие этих спектров используется для количественного определения карбоксигемоглобина в крови.

Для количественного определения готовят ряд растворов:

Р.-р. А - раствор используемой в крови: 1 мл трупной крови на 100 мл фос­фатного буферного раствора (рН 7, 38)

Р.-р. Б - раствор крови, содержащей смесь НbСО и Нb, готовят из раствора А непосредственно перед измерением, добавляя 3- 4 мг дитионита натрия или гидросульфита натрия.

Р.-р. В - раствор крови, в которой все формы гемоглобина полностью пере­ведены в карбоксигемоглобин (этот раствор получают в специальном приборе с использованием склянок Дрекселя).

Чтобы избежать частичного разложения НbСО, работа с содержащими его растворами должна производиться вдали от источников света с минимальным доступом воздуха.

При наложении спектральных кривых НbСО и Нbна одном графике отмеча­ется появление трёх изобестических точек при длинах волн 550, 560, 530 им. В этих точках пересечения спектральных кривых в оптические плоскости рас­творов Нb и НbСО одинаковы. Теперь необходимо найти длину, при которой расстояние между спектральными кривыми будет наибольше вблизи первого максимума поглощения НbСО (541 им). На основании экспериментальных данных эта наибольшая разница значений оптических плотностей растворов Нb и НbСО имеет место при длине волны 538 нм.

В кювету с толщиной слоя жидкости 1 см, вносят раствор А, прибавляют 3 - 4 мг дитионита натрия и измеряют оптическую плотность при длинах волн равных 538 - 550 нм. При измерении оптических плотностей обоих растворов сравнения служит вода.

Расчёт содержание НbСО в процентах производят по формуле:

где ДНbСО,Hb - оптическая плотность раствора Б при длине волны 538 нм

ДНbСО - оптическая плотность раствора В при длине волны 538 нм,

ДНbI - оптическая плотность раствора Б в изобестической точке (550 нм), К - коэффициент 0, 372.

Величина ошибки определения НbСО в пределах концентраций 3 - 20% составляет + 3%, при концентрации свыше 20% погрешность равняется + 5%.