XI. Роль нейраминидазы

Более чем за 30 лет, прошедших после открытия NA:|\ появилось несколько теорий, объясняющих функцию этого фермента в вирионе. Наряду с возможной физиологической ролью, заключающейся .в удалении нейраминовой кислоты муцинов, которые являются ингибиторами NA*, предполагалось, что в процессе репликативного цикла она играет определенную роль либо при проникновении вируса в «летку, либо при высвобождении из клетки вновь синтезированного вируса. В последнее время появились данные о том, что NA* осуществляет еще и четвертую функцию — предотвращает агрегацию образовавшихся вирусных частиц.

На самом раннем этапе исследований предполагалось, что NA* ответственна за проникновение вируса гриппа в чувствительные клетки после того, как вирус прикрепился к поверхностным молекулам нейраминовой кислоты, а для проникновения вирионов в клетку необходимо отщепление этой кислоты (Hirst, 1942). Против этой точки зрения имеется несколько возражений. Вирус с инактивированной при помощи тепловой обработки NA* продолжает проникать в клетку (Faze-kas de St. Groth, 1948), репродуцируясь совместно с активным вирусом (Isaacs, Edney, 1950) и участвуя в генетической рекомбинации с другими вирусами (Burnet, Lind, 1954). Удаление NA* с помощью протеолитических ферментов оказывало влияние на инфекционность штамма WSN (H0N1) (Schulze, 1970). После ингибирования активности NA* с помощью ингибитора ФАНК при концентрации 10~3М, когда происходит практически полное подавление активности фермента, не наблюдается изменение проникновения вируса в клетку (Schulman, Palese, неопубликованные данные). Антитела к NA* не воздействуют на инфекционность вируса гриппа (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966; Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968). Все эти факты свидетельствуют о том, что активность NA* не существенна на ранних этапах репликации вируса гриппа. Можно, однако, предположить, что инактивация или удаление NA с помощью тепловой обработки, протеолитических ферментов, ингибиторов или антител в описанных выше опытах является неполным и что остаточная активность фермента достаточна для осуществления первых этапов репродукционного цикла.

Hoyle (1950) предположил, что NA* воздействует на клеточные субстраты и участвует в процессе отпочковывания вируса от клеточной поверхности. Padgett и Walker (1964) пришли к такому же заключению, показав, что один из вариантов вируса гриппа B/Lee, обладающий низкой активностью NA*, отпочковывается от клеток со скоростью, меньшей, чем у обычного вируса штамма Lee. Указанный вариант, кроме того, имел более низкую скорость роста в процессе репликации. В свете недавних экспериментов с вариантами вируса гриппа типа А, которые различаются друг от друга по содержанию NA* (в 8—10 раз), можно предполагать, что корреляция активности NA* со скоростью роста и выхода вируса из клетки может определяться типом клетки-хозяина.

Если варианты с высоким содержанием NA* реплицировались с более высокой скоростью в куриных эмбрионах и хорионаллантюисных мембранах, то варианты с низким ее содержанием реплицировались до более высокого титра в клане клеток 1-5С-4 (Palese, Schulman, 1974; Schulman, неопубликованные данные).

Аргумент в пользу того, что NA* участвует в высвобождении вируса из «летки, подтверждается экспериментами, в которых антинейраминидазные антитела не влияли на адсорбцию вируса, но подавляли выход вновь синтезированного вируса из клетки (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966;. Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968; Compans et al.,. 1969). Предполагалось, что антитела 'Предотвращают отщепление концевых нейраминовых кислот и таким способом блокируют отделение вирусных частиц, (прикрепленных к молекулам «ейраминовой .кислоты на 'клеточной мембране. Эта схема была подтверждена экспериментами, в которых подавление десорбции вирусных частиц в присутствии антител частично снималось с .помощью добавления избытка бактериальной NA* (Compans et al., 1969; Webster, 1970a). Becht и соавт. (1971.) не подтвердили эти результаты и показали, что .моновалент-ные антитела NA*, присутствующие во время одного цикла репликации вируса, неспособны 'блокировать отделен](е вм-рионов, хотя и подавляют активность NA*. Другого рода экспериментальные данные также заставляют усомниться в ключевой роли NA* во время десорбции вируса. Одинаковое количество нейраминовой 'кислоты отщепляется от инфицированных клеток в присутствии или в отсутствие антител к NA. (Dowdle et al., 1974). Максимально активно NA* синтезируется задолго до момента отпочковывания вируса (Schlesin-ger, Karr, 1957; Lipkind, Tsvetkova, 1973).

Совсем недавно активность бивалентных антител NA* была объяснена на основе их не а'нтинейраминидазной активности,, а способности служить мостиками (или скрепками) междуотдельными вирионами (впервые это предположили Kilbourne и Schulman, 1965) и прикреплять вирусные агрегаты к клеточной поверхности (Kendal, Madeley, 1970; Becht et ai.(, 1971; Dowdle et al., 1974). Естественно, что это свойство антител может быть не единственным механизмом, с помощью которого эти антитела ингибируют репродукцию вируса. В противовес экспериментам Becht и соавт. (1971) с помощью более чувствительного метода редукции размера бляшек, предполагающего наличие многоцикловой вирусной репродукции, было показано, что антитела к NA* ингибируют репликацию вируса (Kilbourne et al., 1974). Во время много-цикловой репликации даже небольшое уменьшение урожая вируса умножается за счет повторения в каждом последующем цикле репродукции. Эти результаты указывают на то,, что по 'крайней мере часть ингибирующей активности антител можно отнести за счет специфического ингибирования NA*. Эксперименты с ФАНК — низкомолекулярным ингибитором NA*, описанные ранее, подтверждают точку зрения, что инги-бирование активности NA влияет на репликацию вирусов, содержащих NA* (Palese et al., 1974a; Schulman, Palese, 1975),

и указывают на то, что активность NA* все же существенна для процесса репликации вируса.

Новая теория роли вирусной NA*, заключающейся в предотвращении вирусной агрегации, была предложена после проведения экспериментов с ts (температурочувствительными) мутантами вируса гриппа. Эти эксперименты указали еще раз на важную роль фермента в цикле репликации вируса гриппа-(Palese et al., 1974b, c). Sugiura и соавт. (1972) изолировали ts-мутанты вируса гриппа WSN (HON1), каждый ,из которых попадал в одну из нескольких комплементационных групп. Было показано, что два из этих мутантов являются нейрами-нидазодефектными (Palese et al., 1974b). При непермиссивных температурах нейраминидазодефектные мутанты дают частицы, содержащие нейраминовую кислоту в своей оболочке и образующие большие агрегаты. Ранее было показано,, что оболочка частиц вируса гриппа и участки клеточных мембран, где отпочковывается вирус, лишены нейраминовой кислоты, вероятно, за счет присутствия вирусной NA* (Klenk et al., 1970). Было высказано предположение, что удаление нейраминовой кислоты может быть необходимым этапом сборки вирусной частицы (Klenk et al., 1970). Результаты, полученные с помощью нейраминидазодефектных мутантов, указывают на то, что морфологически интактные вирусные частицы с нейраминовой кислотой на поверхности своей оболочки могут отпочковываться от клетки, но делают это в виде агрегатов, а не индивидуальных вирионов (22). В связи с тем что в этом случае вирионы имеют сиаловую кислоту на своей поверхности, НА* соседних вирусов могут «принять», вирусный чехол за рецептор и скрепить вирионы друг с другом, что приведет к образованию больших агрегатов. Интересные результаты были получены Schulze (1975) при изучении эффектов, сопровождающих искусственное прикрепление сиаловой кислоты к поверхности вируса гриппа штамма WSN in vitro. Эта процедура также приводила к образованию небольших агрегатов (см. гл. 3). Наблюдаемое при этом увеличение инфекционности вируса после прикрепления к его-поверхности in vitro сиаловой кислоты можно объяснить объединением неинфекционных вирионов в агрегаты по 2—4 частицы. Такой же феномен описали Hirst и Pons (1973).

Теория о такой функции NA* предполагает, что только те-вирусы, которые, имеют в своем составе гемагглютинин,. взаимодействующий с сиалосодержащим рецептором клеточной поверхности (т. е. орто- и парамиксовирусы), требуют наличия нейраминидазы. Этим объясняется, почему другие отпочковавшиеся от поверхности вирусы нейраминидазы не содержат. Основываясь на довольно ограниченных данных, можно, вероятно, утверждать, что такие вирусы, 'как РНК-со-держащие онкогениые вирусы, вирусы VSV, Синдбис и раб-довярусы, содержат «а своей поверхности нейраминовую кислоту (Burge, Huang, 1970; Klenk, Chippin, 1971; Lay, Dues-berg, 1972; Schulumberger et al., 1973; Krantz et al., 1974).. Включение нейраминовой кислоты в оболочку всех отпочковывающихся вирусов может происходить в процессе их созревания, только орто- и парамиксовирусы должны удалять со< своей поверхности нейраминовую кислоту для того, -чтобы предотвратить агрегацию.

При изучении вирусов, обладающих температурочувстви-тельной нейраминидазой, с помощью метода электронной: микроскопии было обнаружено, что эти вирусы охотнее агрегируют друг с другом, чем адсорбируются на рецепторах клеточных мембран, содержащих нейраминовую кислоту. Одно-из объяснений указанного выше фа^та может заключаться в том, что во время отпочкования вир ионы 'находятся в очень тесном контакте друг с другом на поверхности мембран и при десорбции с клетки остаются прикрепленными друг « другу, а не переходят на поверхность клетки. На 22 можно видеть феномен агрегации нейраминидазодефектных мутант-ных вирусов, растущих при непермиссивных температурах. Подобный эффект можно наблюдать, если мутант выращивают при пермиссивных температурах в присутствии ФАНК, ингибитора нейраминидазной активности. При этих условиях действие вирусной нейраминидазы подавляется, а вирионы имеют в своем составе рецепторы, содержащие нейраминовую кислоту, что является причиной их агрегации (Palese,, Compans, 1975).

Кроме того, функция вирусной нейраминидазы заключается, очевидно, в отщеплении остатков нейраминовой кислоты от клеточных мембран и слоев муцина, что предотвращает реадсорбцию вируса на этих рецепторах. Этот факт может быть особенно важным в естественном инфекционном процессе, когда вирус взаимодействует со слоями муцина или другими ингибиторами гемагглютинации. Нейраминидаза же-может не только дезагрегировать вирусные частицы, но и предотвращать их адсорбцию на этих гликопротеидах, что позволяет вирионам инфицировать новые чувствительные клетки. Таким образом, нейраминидаза может осуществлять в репликативном цикле не одну, а несколько функций.