3.3. Об элементарных генераторах первичного митогенного сигнала
В связи с рассмотрением механизма действия стимуляторов роста и опухо-левых промоторов важно обсудить возможное устройство генераторов митоген-ного сигнала, их пространственно-временные организацию и функциониро-вание. Прежде всего, логично полагать, что в этих образованиях с помощью отрицательной обратной связи реализуется циклический (периодический) прин-цип управления, не допускающий перерегулирования. Одни короткоживущие молекулы DAG через PKC в сигнальной PPI-системе обеспечивают лишь кратковременное функционирование «собственного» рецептора, при содейст-вии которого они образовались, а также прерывают действие рецепторов различных факторов роста. Другие же такие молекулы подвергаются ряду преобразований, чтобы обеспечить прохождение зародившегося митогенного сигнала к последующему этапу – высвобождению и метаболизму арахидоновой кислоты по LOX- и COX-путям. После того как задействованная в процесс порция DAG отработает свой «ресурс», цикл заканчивается, и соответствующие локальные системы по выработке биохимического митогенного сигнала перехо-дят в режим ожидания следующей порции короткоживующего активатора PKC. Очевидно, эти общие принципы могут и должны быть реализованы лишь буду-чи оформлены в виде конкретных организационной структуры и конструкции. В этой связи мы предполагаем, что в клеточной мембране существует набор идентичных дискретных единиц (модулей) по производству митогенного сигнала с комплектом необходимых ферментов в каждом модуле, т. е. множе-ство независимых несинхронно работающих генераторов такого сигнала.
3.3.1. Идея об элементарных «митогенных» единицах в плазматической мембране вытекает из того, что различные мультиферментные комплексы в клетке, как правило, скомпонованы в виде конкретных объёмно-блочных моду-лей. Так, комплекс дыхательных ферментов и ATPаза организованы в элемен-тарную структурную единицу определённой формы (элементарный генератор производства ATP), множество которых локализовано на внутренней мембране митохондрий. Постулировано существование комплексов гликолитических ферментов (гликолитических метаболонов), компартментализованных на опре-делённых внутриклеточных структурах (см. п. 2.1.3 и 2.1.12). В ядерном матриксе расположены репликативные мультиферментные комплексы (репли-тазы) сферической формы (Noguchi et al., 1983). Наиболее полно идеи образо-вания ферментами определённого метаболического пути структурно упорядо-ченных комплексов (метаболонов), функционирующих как единая система, развиты в работах Курганова (1985, 1986). По его мнению, современнная теория контроля метаболизма должна обязательно учитывать изменение каталитичес-ких свойств ферментов в результате самоассоциации, ассоциации с другими ферментами и/или адсорбции на клеточных мембранах, цитоскелете, струк-турных белках.
В каждый данный момент какое-то количество элементарных генераторов митогенного сигнала находится в активном состоянии, а остальные – в выклю-ченном, и внутриклеточная система передачи, реагируя лишь на суммарный митогенный сигнал, срабатывает только при превышении его величины некото-рого определённого уровня (порога чувствительности). Кроме самой величины интегрального стимулирующего сигнала, существенна ещё и длительность его воздействия. Последняя, очевидно, должна быть такой, чтобы успеть подготовить и активировать до необходимого уровня все последующие стадии передачи и преобразования сигнала. Преждевременный срыв митогенного воз-действия можно уподобить срыву какой-либо производственной операции из-за недостаточной подготовленности требуемого ресурса.
Таким образом, теоретически для возбуждения митогенеза должны, как минимум, соблюдаться два условия:
∆MS)i
> (MS)П,
TMS ≥ (TMS)П,
где (∆MS)i – величина митогенного сигнала i-го действующего элементарного генератора; (MS)П – пороговое значение суммарного митогенного сигнала; TMS и (TMS)П – соответственно длительность воздействия суммарного сигнала и её пороговое значение.
Представления об элементарных генераторах митогенного сигнала можно совместить с данными о том, что для действия стимуляторов роста необходима начальная стадия перераспределения рецепторов, а именно склеивание их в небольшие группы – кластеры (см. Васильев, Гельфанд, 1981; Кульберг, 1987). Образование подобных кластеров может оказаться приспособительным актом, смысл которого – формирование из слабых элементарных первичных сигналов более мощного аддитивного, способного надёжно преодолевать порог чувстви-тельности и совместно с другими аналогичными кластерами запускать «мем-бранный» и «энергетический» каналы управления клеточным циклом (Лю, Ефимов, 1978). К тому же, каждый рецептор в одиночку не способен исполь-зовать для индукции изменений в клеточной активности уникальный набор сигнальных белков (Brugge, McCormick, 1999). Ведь многие из них, например, тирозинкиназы семейства src, фосфатидилинозиткиназы, малые GTPазы (Pac, Pho), митогенактивированные протеинкиназы (МАР-киназы), факторы транс-крипции, непосредственно участвуют в регуляции внутриклеточного сигналь-ного пути. Со сказанным в принципе согласуется главная идея модели динами-ческой кластеризации рецепторов, разработанная для гормональной регуляции аденилатциклазным комплексом (Воейков, 1984). Здесь также ведущая роль отводится некрупным кластерам рецепторов как основной функционально активной их формы. Такие кластеры распределены по всей поверхности плаз-матической мембраны, и каждый из них, реагируя на возбуждающие экстра-клеточные сигналы как единое целое, соответственно откликается на них кооперативным образом.
К обсуждаемому феномену, по-видимому, имеет отношение и, казалось бы, парадоксальная ситуация, отмечаемая рядом исследователей. Она состоит в том, что при снижении пролиферативной активности клеток увеличивается количество рецепторов фактора роста, в частности эпидермального, и наоборот, митогенная стимуляция этим фактором роста сопряжена с резким уменьшением содержания тех же рецепторов. Такое явление зафиксировано, например, на культивируемых эпителиоцитах из лёгкого мыши: экспрессия рецепторов EGF в делящихся клетках было ослабленной, а при остановке роста культуры содер-жание рецепторов EGF возрастало. По мнению авторов данного исследования (Rice et al., 1999), названные рецепторы выполняют при дифференцировке клеток лёгкого определённую функцию, отменяемую в случае пролиферации и неопластического роста.
При указанном понимании нормального процесса формирования общего стимулирующего сигнала значение последнего будет определяться как количеством действующих в данный момент лигандорецепторных комплексов, так и качественным состоянием сопряжённых с ними мультиферментных «митогенных» структурных единиц. Активацию PKC экзогенным трудномета-болизируемым TPA в конкуренции с эндогенным короткоживущим DAG за места связывания можно рассматривать, по-видимому, уже как нарушение нормального циклического режима, поскольку удлиняется рабочая часть цикла и соответственно увеличиваются продолжительность действия PLC и PLA2, время активации липо- и циклооксигеназами метаболизма арахидоновой кис-лоты – составного компонента процесса стимуляции пролиферации на началь-ной стадии. Но более опасными будут негативные последствия при подмене ферментативной липооксигенации прямым и непрерывным свободнорадика-льным окислением, как в случае образования условий для развития в клетке глобального ПОЛ. При этом образуются высокоактивные эффекторные проду-кты типа изопростанов (аналогов простагландинов), изолейкотриенов и других изооксилипинов, которые, как считают (Дятловицкая, Безуглов, 1998), «пред-ставляют собой новый класс липидных эффекторов, являющихся медиаторами окислительного стресса».
3.3.2. К процессу кластеризации рецепторов и организации «митогенных» генераторов кластерного типа, возможно, причастны сфинголипиды и про-дукты их гидролиза. Роль последних в регуляции клеточных процессов в последние годы интенсивно изучается, и особенно значимым здесь считают сфингомиелиновый цикл, метаболиты которого церамид и сфингозин обладают свойствами вторичных мессенджеров (Hannun, Obeid, 1994; Алесенко, 1998). Как представляется нам, немаловажным свойством сфинголипидов и, в част-ности, сфингомиелина является также их оксирезистентность – условие, необходимое для эффективного участия их в различных, прежде всего, регуля-торных процессах, происходящих при повышенном уровне рО2 (например, при окислительном митогенезе нормальных клеток). Единственный в этом случае способ нарушения структуры того же сфингомиелина и выполняемых им функ-ций – ферментативный с помощью активированной сфингомиелиназы. Кроме того, активность последней (во всяком случае, нейтральной Mg-зависимой сфингомиелиназы), напротив, угнетается in vivo липофильными антиокси-дантами, в частности, коэнзимом Q10 плазматической мембраны гепатоцитов, что, по мнению исследователей (Martin et al., 2001), предотвращает накопление церамидов и клеточную смерть. В печени мышей указанная сфингомиелиназа ингибировалась также антиоксидантом GSH, что вызывало накопление сфинго-миелина и сопровождалось уменьшением содержания продуктов ПОЛ – диено-вых конъюгатов и диенкетонов (Цюпко и др., 2001). А при, возможно, уме-ренном даже окислительном стрессе (окислительном митогенезе) эта защита, надо полагать, устраняется, и возникают условия для гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой.
Указанные, казалось бы, прозаические обстоятельства позволяют предпо-ложить, что одним из возможных регуляторных механизмов, реализуемых системой «сфингомиелин – сфингомиелиназа», может быть так называемый «барьерный» («интеркалирующий»). В этом плане интересны следующие дан-ные. Сфингомиелин проявляет регулирующее действие на синтез ДНК, изменяя структуру двойной спирали: низкие концентрации этого сфинголипида стаби-лизируют двойную спираль ДНК, а высокие – дестабилизируют её. Стабили-зация происходит по мере завершения репликации ДНК, дестабилизация же, сопровождающаяся увеличением концентрации сфингомиелина в хроматине и ядерном матриксе, необходима для активного синтеза ДНК. Дестабилизиру-ющий эффект сфингомиелина определяется интеркалирующим действием сфингозина и приводит к выделению части ДНК в составе репликативной вил-ки в виде однонитевидных репликативных интермедиатов. При этом созда-ются условия для нормального функционирования ДНК-полимеразы α, диаметр молекулы которой значительно превышает диаметр двойной спирали ДНК (Левицкий, Губский, 1990).
Кстати, церамиды, продукты гидролиза сфингомиелина, вызывают межнук-леосомную фрагментацию ДНК, характерную для апоптоза (Стручков, Страже-вская, 1999). Не исключено, что они тоже обладают интеркалирующим дейст-вием, направленным в данном случае на разъединение нуклеосом. Повышение в период окислительного митогенеза содержания сфингомиелина необходимо также для прикрепления с его участием ДНК к ядерному матриксу (см. там же) – условие, обязательное для нормального устойчивого протекания синтеза ДНК. Не случайно и то, что в повышенной окислительной ситуации, харак-терной для стадии пролиферации, надёжное прикрепление к матриксу осуще-ствляет устойчивый к окислению сфингомиелин.
Увеличение содержания сфингомиелина и продуктов его гидролиза в ядрах активно пролиферирующих клеток подтверждается и другими работами (см. Алесенко и др., 1993). В интактных ядрах клеток печени крысы сфингомиели-наза связана главным образом с ядерной оболочной, в регенерирующей же печени во время интенсивного синтеза ДНК она транслоцируется в ядерный матрикс. Количество сфингомиелина снижается соответственно повышению содержания сфингомиелиназы (Alesenko, Chatterjee, 1995), и эта зависимость, похоже, отражает процесс репликации ДНК в динамике, указывая как бы дви-жение в направлении завершения S-фазы. Однако, по другим данным (Albi, Viola, 1997), увеличение активности сфингомиелиназы, выявленной в хрома-тине ядер гепатоцитов, происходит уже при вхождении их в S-фазу после гепатэктомиии.
Возвращаясь к феномену кластеризации рецепторов митогенных агентов в ростстимулированных клетках, отметим, что принцип интеркаляции мог быть использован природой и применительно к этим рецепторам. Тот же сфин-гомиелин выполняет, возможно, разъединяющую функцию, вследствие чего рецепторы в плазматической мембране нестимулированных к пролиферации клеток присутствуют в основном как относительно простые и одинокие диск-ретные структуры. В таких клетках часто обнаруживают большое количество рецепторов, что в принципе объяснимо при их независимой и раздельной встро-енности в мембрану. Однако с возбуждением первичного «промитогенного» сигнала в плазматической мембране происходит ряд изменений, и одним из необходимых ранних событий здесь предполагается активация сфингомиели-назы. Под её влиянием устраняется интеркалирующее, разъединяющее дей-ствие сфингомиелинового барьера, обеспечивается локальное снижение мик-ровязкости мембраны, и разрозненные ранее индивидуальные рецепторы, перемещаясь в плоскости плазматической мембраны, могут теперь беспрепят-ственно сближаться между собой и объединяться в небольшие группы.
Одновременно сфингомиелиназа устраняет ингибирующее действие разли-чных молекулярных форм сфингомиелинов, которое они оказывают на некото-рые PLCs. Данные о таком ингибировании получены, например, в отношении PLC-δ1, причём степень ингибирования этой фосфолипазы зависит от длины и степени ненасыщенности жирных кислот сфингомиелинов (Pawelczyk, Lowen-stein, 1997). Таким образом, указанные действия сфингомиелиназы логично свя-зывать с участием её в начальных стадиях зарождения митогенного сигнала.
Любопытно, что сфингомиелиназа, индуцируя кластеризацию мембранных белков, усиливает взаимодействие рецепторов EGF с цитоскелетом. Это пока-зано на примере культур клеток ЗТЗ, причём ассоциация указанных рецепторов с цитоскелетом не зависит от их киназной активности и С-концевого участка, содержащего сайт аутофосфорилирования. Отсюда было решено: кластериза-ция рецепторов EGF лежит в основе их ассоциации с цитоскелетом (Van Belzen et al., 1990). Вообще же, кластеризация любых рецепторов не обходится, оче-видно, без соответствующего перераспределения белков цитоскелета в зоне контакта их с рецепторами. Названные выше структурные образования совме-стно с сопряжённым с ними комплектом определённых ферментов в клеточной мембране и выполняют, на наш взгляд, функцию «митогенных» генераторов кластерного типа. После включения митогенного каскада, активации PLC и PLA2, высвобождения «многоцелевых» DAG и арахидоновой кислоты после-дние могут использоваться и для активации сфингомиелиназы (Алесенко, 1998). Эти медиаторы гидролиза сфингомиелина, возможно, в качестве положи-тельной обратной связи поддерживают в ростстимулированных клетках усло-вия для кластеризации рецепторов, эффективного действия указанных выше «митогенных» генераторов.
Изложенный механизм допускает спонтанную агрегацию рецепторов без участия каких-либо внешних стимулов, если в клетке создаются условия для активации в числе других мембранных ферментов и сфингомиелиназы, напри-мер, при устранении или ослаблении действия ингибирующих её активность антиоксидантов (см. выше Martin et al., 2001). Но некоторые моменты остаются всё же вне понимания. Неясно, например, как по указанной модели может реализоваться избирательная агрегация рецепторов, о которой Кульберг (1987) сказал, что «в случае индуцированной какими-либо реагентами агрегации рецепторов определённого типа общих «возмущений» клеточной поверхности не происходит: реагент, действие которого направлено на определённый рецеп-тор, не оказывает влияния на поведение других типов рецепторов».
Не исключено также, что «барьерные» обязанности возложены и на другие типы сфинголипидов, например, на ганглиозиды. Молекулы последних отлича-ются большими размерами и являются главными компонентами рецепторных участков на поверхности клеточных мембран (Степанов и др., 1991). Эти осо-бенности могли быть приспособлены для выполнения ганглиозидами функций разъединения и рассредоточения, в частности, рецепторов. При стимуляции клеток ганглиозидные препятствия могут каким-то образом устраняться, а раз-розненные до этого рецепторы – объединяться в кластеры. Можно предполо-жить, например, что в норме при окислительном митогенезе происходит «сбра-сывание» ганглиозидов с клеточной поверхности. Этот феномен, как известно, характерен для опухолевых клеток (Кузнецов, 1992; Kong et al., 1998), у кото-рых, несмотря на отсутствие ганглиозидного барьера, кластеризация рецеп-торов всё же нарушается, что, вероятно, определяется более серьёзными деста-билизационными процессами в плазматической мембране, на её наружной и внутренней поверхностях и внеклеточном матриксе. Как бы то ни было, пред-положение об антикластерной и, по сути, антипролиферативной роли гангли-озидов в норме не противоречит другому: сбрасываемые с клеточной поверх-ности ганглиозиды защищают от негативного влияния иммунных факторов стимулированные к росту нормальные клетки, однако, являясь иммуномо-дуляторами и понижая противоопухолевый иммунитет организма, способст-вуют развитию опухолевого процесса (Дятловицкая и др., 1997; Ravindranath-Gonzales, 2000).
Заслуживает также внимания и следующий обсуждаемый в научной печати вопрос. Согласно общепринятому мнению, клетка воспринимает информацию от регуляторных пептидов только через рецепторы, ассоциированные с соответ-ствующими ферментами в плазматической мембране, и систему вторичных посредников, изменяющих скорость и (или) направленность внутриклеточных биохимических процессов. Исключение, наверное, составляет часть «гормона-льной» информации, непосредственно переносимая к ДНК с помощью образу-ющихся в клетке гормонорецепторных комплексов, которые и активируют процесс транскрипции. Однако в последнее десятилетие указанное положение было поколеблено в связи с экспериментальными данными о способности мно-гих регуляторных пептидов взаимодействовать с липидным матриксом мемб-раны и вызывать изменения в ходе внутриклеточных процессов независимо от рецепторов (Рыбальченко и др., 1991; Hianik, Laputkova, 1991).
Обсуждая роль таких взаимодействий, Рыбальченко с соавт. (1993) выска-зали следующие соображения: «При адсорбции на липидном бислое молекулы регуляторных пептидов могут приобретать определённую информацию, необ-ходимую для связывания с рецепторами. Вероятно, это позволяет клетке вос-принимать информацию от имеющихся в растворе различных конформеров одного пептида. Далее, находясь в липидном окружении, молекулы регулятор-ных пептидов могут влиять на различные мембраносвязанные белки и изменять физико-химические характеристики самого липидного матрикса плазматичес-кой мембраны. В результате может в значительной степени повысится количе-ство воспринимаемой клеткой информации». Но каков бы ни был конкретный механизм взаимодействия регуляторных пептидов с липидным бислоем мемб-раны, данный канал проведения информационного сигнала внутрь клетки будет, очевидно, нарушен при избыточном ПОЛ. Это обстоятельство наряду с другими обсуждавшимися нами причинами тоже причастно к утрате нормаль-ной реактивности опухолевых клеток к контролирующим рост факторам.