1.8. Старение клеток in vitro

Клетки стареют не только in vivo, но и in vitro. Более того, в условиях in vitro особенно отчётливо проявляется роль гипероксии – естественного и, по-видимому, единственного в этих условиях фактора их старения.

1.8.1. Как известно, выращивание клеток вне организма проводится в специальных сосудах (флаконах) при атмосферном давлении и, следовательно, при рО₂, значительно превосходящем значения, которые устанавливаются в организме в норме. Обычно в инкубационной жидкости рО₂ близко к рО₂ воздуха. Молекулы О₂ через тонкий слой питательной среды во флаконе свободно диффундируют к клеткам и внутри них устанавливается высокое рО₂, невозможное in vivo или, во всяком случае, превышающее допустимые значения.

С точки зрения кислородно-перекисной концепции старения, условия in vitro представляются более чем подходящими для изучения процесса старения клеток, так как в этих условиях он протекает интенсивнее, в ускоренном темпе и, что очень важно, в «чистом» виде, т.е. при полном отсутствии какого-либо влияния систем организма, которое имеет место при старении in vivo. Данное обстоятельство сразу ставит многие теории старения в разряд второстепенных или сугубо умозрительных, поскольку возрастные изменения происходят или могут происходить и без реализации постулируемых в них положений. Придание нами столь важного значения феномену старения клеток in vitro связано с тем, что именно в этих «простых» условиях можно будет скорее и с меньшими трудностями познать физико-химические основы старения и сущность биологии этого процесса вообще.

В настоящее время, однако, не существует единого мнения по поводу общности причин и механизмов старения клеточных культур и старения клеток в составе многоклеточного организма, о чем свидетельствуют противоположные точки зрения в литературе (Капитанов, 1986). Канунго (Kanungo, 1982), например, хотя и считает, что причина старения организма состоит в старении его клеток, вместе с тем полагает: «условия in vitro не соответствуют физиологическим и свойства клеток могут оказаться измененными. Если исследования in vitro и дают некоторую полезную информацию о самой клетке, то они имеют ограниченную ценность, когда речь идёт о старении организма в целом». С приведенным высказыванием можно согласиться лишь отчасти. Действительно, старение клеток in vitro не может отразить весь сложный спектр возрастных изменений, происходящих в целостном организме на всех уровнях и, к тому же, в немалой степени определяемых системой различных связей в нем, в том числе обратных. Применительно к условиям in vitro теряет смысл ряд принципов старения, проявляющихся на организменном уровне (см. п. 1.1.2), но некоторые из них продолжают действовать и в клеточных культурах. Таковы, в частности, многоочаговость процесса старения, т.е. развитие повреждений в различных частях клетки или в различных ее молекулярных циклах, и гетерохронность старения среди клеток одного культивируемого типа. Кроме того, в этих условиях принципы необратимости, нерегулируемости и непрерывности старения клеток должны, очевидно, проявляться более явственно.

Указанные выше недостатки при изучении старения клеток вне организма не представляются принципиальными, если иметь в виду, что одна из основных задач геронтологии состоит в установлении главного первичного фактора ок-ружающей среды, предопределяющего старение всех живых организмов. Таким фактором, как мы полагаем, является гипероксия в земной атмосфере, поэтому жизнь клеток в условиях in vitro можно считать удобной экспериментальной моделью для изучения действия именно указанного физического фактора на их старение. Обычное 18-21 %-ное содержание О₂ в воздухе и соответственно высокие уровни дисбаланса Δ (ПО – АО) и пероксигеназных процессов оказывают угнетающее действие на субклеточные элементы, на нормальные физиологические и метаболические процессы. В результате последние постепенно затухают, и большинство клеток погибает вследствие окислительного цитолиза или по кислородно-перекисному механизму апоптоза (см. п. 7.1).

Фактов, указывающих на ведущую роль избыточных рО₂, АФК и ПОЛ в снижении выживаемости клеток в условиях in vitro и протекторного действия различных антиоксидантных факторов, более, чем достаточно (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner et al., 1998). К числу последних отнесен недавно и L-карнозин. Добавление физиологических концентраций его к стандартным средам увеличивает продолжительность жизни фибробластов челове-ка in vitro и замедляет процессы физиологического старения в них. Длительно пассируемые на обычных средах клетки после переноса их в карнозин-содер-жащую среду проявляли омолаживающий эффект. Оптический же изомер D-карнозин не обладал указанными свойствами (Холлидей, МакФарланд, 2000) В то же время в ходе длительного культивирования определённый процент клеток не только не деградирует, но и, адаптируясь к токсическим окислительным условиям, «добивается» того, что внутриклеточный параметр Δ (ПО – АО) не повышается до высоких значений Δ_А2 или Δ_Ц, но может остановиться на несколько меньшем уровне Δ_К, необходимом для их злокачественной трансформации. Случаи «спонтанной» малигнизации клеток в культуре и возможный ее механизм обсуждаются нами отдельно в главе 4.

1.8.2. Приведенные выше соображения можно считать частью наших теоретических положений о причинах и следствиях старения клеток in vitro. Для подтверждения и развития этих положений естественно привлечь некоторые уже известные факты, содержание и смысл которых легко могут быть «вписаны» в кислородно-перекисную концепцию старения клеток. Начнем с того, что вышеописанные обычные условия культивирования клеток, являющиеся для них токсическими, могут быть смягчены путем искусственного снижения концентрации О₂ в газовой среде. При этом угнетающее действие гипероксии и скорость старения клеток должны снизиться. Следует также иметь в виду, что такая известная биологическая константа, как лимит Хейфлика, в действительности оказалась переменной величиной, зависящей от содержания О₂ в газовой среде, причем в условиях оксидативного стресса этот лимит уменьшается, а при снижении рО₂, напротив, возрастает (Chen et al., 1995).

Действительно, пребывание культуры фибробластов в атмосфере с пониженным содержанием О₂ (10 %) удлиняет срок их жизни на 20-30 %. То же происходит и с клетками легких человека и мышей (Packer, Walton, 1977). Период пролиферативной жизнеспособности диплоидных фибробластов IMR90 человека с различными исходными уровнями удвоения популяции увеличива-ется при снижении содержания О₂ в среде до 1,6 или 12 %. Этот период при 1 % О₂ возрастает на 22 %, а возвращение культур из среды с 1 % О₂ в среду с 20 % О₂ быстро развивает их старение. В культуре диплоидных фибробластов от больного синдромом Вернера (раннее старение) продолжительность репликативной жизнеспособности также возрастает при снижении рО₂ (Saito et al., 1995). Замедление старения культивируемых хондроцитов куриного эмбриона показано при 8 %-ном содержании О₂ в атмосфере по сравнению с контролем (18 %), причём опытные клетки дольше сохраняли признаки «молодых», имели более высокую скорость пролиферации (Nevo et al., 1988). Под влиянием различных антиоксидантов скорость пролиферации клеточных культур также уве-личивается, а старение их замедляется (Packer, Walton, 1977; Обухова, 1986), что подтверждает уже сказанное выше: явно избыточное действие оксидантов подавляет пролиферацию клеток и обусловливает ускоренное их старение.

В экспериментах с клеточными культурами сравнительно легко проверить также действие О₂-зависимого механизма регуляции количества дыхательных ферментов (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) и митохондрий (Озернюк, 1978). Согласно этому механизму, при плавном и медленном возрастании уро-вня гипероксии содержание таких ферментов и число митохондрий должны постепенно нарастать, а при гипоксии, наоборот, – падать. Действительно, при выращивании культуры фибробластов на среде с пониженным содержанием О₂ концентрация цитохромов значительно снижается (Pius, 1970). Здесь, безусловно, задействован объективный процесс адаптации дыхательной системы к внутриклеточному уровню рО₂. Однако в данном феномене не меньшее значение имеет скорость адаптации, от которой будет зависеть и интенсивность старения культивируемых клеток. Кажется очевидным, что в процессе биологической эволюции многоклеточный организм приспосабливался к постепенному нарастанию рО₂ в земной атмосфере также постепенно. При этом внутри клеток самым эффективным можно считать «митохондриальный» механизм адаптации: количество ферментов дыхательной цепи и самих митохондрий варьируется самоорганизующейся системой так, чтобы оно обеспечивало целостность и относительно нормальное функционирование клеток при изменениях внутриклеточного рО₂ в определённых эволюционно апробированных уже пределах.

Совсем иная ситуация складывается при быстром перенесении клеток из живого организма в условия in vitro. Резкий перевод их в состояние гипероксии равносилен нанесению им значительного скачкообразного возмущающего воз-действия, к которому они, вообще говоря, не подготовлены. Как же реагирует первичная клеточная культура на такое возмущение? По-видимому, на протяжении определенного начального периода культуральная среда является для клеток «стрессовой», а состояние самих клеток в этот период – шоковым. Затем какое-то время затрачивается на подготовку и проведение возможных в этих экстремальных условиях адаптивных «мероприятий» антиоксидантного характера. Вероятно, за счёт последних на первых порах удается не только избежать окислительной деградации, но и создать условия для стимуляции пролиферативного процесса, снизив высокий вначале явно «цитотоксический» внутриклеточный дисбаланс Δ_Ц (ПО – АО) до необходимого для окислительного митогенеза. Однако и эта стадия в жизни первичной культуры не может не ограничиваться непрерывно угнетающей ее гипероксической средой. В данной ситуации начинает инактивироваться сам адаптивный механизм, соответственно снижается наращивание антиоксидантной системы, а в последующем про-исходит и регрессия последней. При высоком уровне ПОЛ, прежде всего, повреждаются митохондрии (см. п. 1.3), количество которых продолжало бы возрастать как приспособительный акт в случае постепенного повышения рО₂ в газовой среде.

Неспособность адаптивных механизмов клетки к быстрой и полной нейтрализации внезапно возникшей гипероксии, с одной стороны, и высокая уязвимость митохондриального звена при пероксидативных стрессах, с другой, определяют необратимый процесс дегенерации клеток после возникновения в них «критического уровня» повреждений. Важно здесь ещё раз отметить: деструктивные изменения именно в митохондриях как основных потребителей О₂ и в этом смысле как главной, антикислородной ступени защиты в антиоксидантной системе клетки не оставляют надежд на выживание для большинства клеток в жестких условиях in vitro, поскольку в этом случае расстраивается сам адап-тивный механизм снижения внутриклеточного рО₂ и уровня ПОЛ. Приведенные соображения полностью согласуются с первичной ролью изменений митохон-дрий в инициации механизма старения, постулированной, правда, примени-тельно к культивируемым in vitro фибробластам (Kanungo, 1980).

Пероксидативный стресс и токсический эффект в условиях in vitro могут быть ещё более усилены, если в культуральную среду ввести катализаторы ПОЛ, например ионы Fe²⁺ или Cu²⁺. Действительно, добавление в среду культивирования сульфата меди в концентрации 60 мг/л приводило к достоверному снижению средней продолжительности жизни коловраток на 9 %, а также к существенно более заметному, чем в контроле, нарастанию количества MDA. Авторы этого эксперимента (Enesco et al., 1989) логично полагают, что сокра-щение продолжительности жизни происходит вследствие ускорения ионами меди процессов генерации свободных радикалов. Указанная концентрация сульфата меди оказалась оптимальной, так как бóльшие (90 и 180 мг/л) были слишком токсичными для коловраток, а меньшая (30 мг/л) – малоэффективной.

Таким образом, необратимые ускоренные старение и окислительная деградация клеток при резкой смене среды обитания с in vivo на in vitro являются следствием недостаточной готовности их без серьезных негативных последствий воспринять столь крутое усиление кислородного воздействия. Если такой резкий перевод в новые условия заменить «мягким», например, многоступенчатым и растянутым во времени, то можно ожидать, что присущая клеткам способность адаптироваться к постепенно нарастающей гипероксии в этом случае реализуется в полной мере. Более того, в принципе таким способом можно добиться адаптации клеток не только к обычному 18-21 %-ному уровню О₂ в атмосфере, но и к существенно превышающим его искусственно создаваемым гипероксическим средам. В подтверждение сказанному сошлемся на весьма убедительные факты, полученные Велком с соавт. (Valk et al., 1985). В результате постепенной адаптации к возрастающей концентрации О₂ ими получена линия клеток яичника китайского хомячка, устойчивая к высокому содержанию О₂ и способная пролиферировать даже при 99 % О₂ в атмосфере. К столь значительной гипероксии и зависимым от нее процессам оказались адаптированными все ступени защиты – антикислородная, антирадикальная и антиперекисная (подробнее об этих результатах см. в главе 4).

1.8.3. Изложенные соображения об особенностях изменения прооксидан-тно-антиоксидантного дисбаланса в культивируемых клетках как основного действующего фактора их старения и трансформации можно условно представить графически (см. рис. 11). На кривой 1, отражающей указанные изменения при быстром перемещении клеток в среду in vitro, выделены три последо-вательные во времени этапа, которые, похоже, соответствуют известным в литературе адаптационной (латентной) фазе, фазе логарифмического роста и стационарной фазе. При этом старение клеточных культур обычно связывается с процессами в стационарной фазе, где со временем они претерпевают различные изменения, сходные с наблюдающимися в клетках в составе стареющего организма (Капитанов, 1986; Хохлов, 1988). В частности, при старении клеток in vitro изменяются ферменты, происходит их анэу- и полиплоидизация (Re-macle, 1989). Как и клетки in vivo, культивируемые клетки по мере старения накапливают липофусциновые гранулы (Обухова, Эмануэль, 1984), указывая на очевидное протекание перекисных процессов и окислительные нарушения в структуре липидов и белков. Эти и ряд других фактов так или иначе могут быть согласованы с гипотезой о кислородно-перекисном (свободнорадикальном) ме-ханизме старения. Более же всего, в пользу такого механизма свидетельствуют данные о том, что при повышении концентрации антиоксидантов продолжительность жизни клеток in vitro больше, а при понижении – меньше, чем в контроле. Такие результаты получены, например, при изменении содержания GSH в фибробластах человека (Shuji, Matsuo, 1988), каталазы и SOD – в куль-тивируемых нейронах (Drukarch et al., 1998).

Что касается пологих и тносительно плавно возрастающих кривых 2 на рис. 11, то такой характер их объясняется тем, что за каждым небольшим искусственно создаваемым приращением прооксидантной составляющей дисбаланса Δ (ПО – АО) в клетке следует с некоторым запаздыванием соответствующее адаптивное приращение в ней антиоксидантной компоненты. Многократ-ное повторение этой акции и обеспечивает приспособление и выживаемость клеток при постепенном, ступенчатом повышении уровня гипероксии.

В обоих указанных случаях обратим внимание на варианты, ведущие к так называемой «спонтанной» малигнизации клеток (см. главу 4). Этот феномен, с нашей точки зрения, может реализовываться лишь в тех клетках, где дисбаланс достигает значений Δ_К, устойчиво удовлетворяющих неравенству (см. п.1.1.2)

Δ_П (ПО – АО) < Δ_К (ПО – АО) < Δ_Ц (ПО – АО),

а точнее, с учетом «апоптозных» дисбалансов, – соотношению (см. п. 7.1.1)

Δ_А1 (ПО – АО) < Δ_К (ПО – АО) < Δ_А2 (ПО – АО).

С помощью подобных процедур, в конечном счете, формируются перевивные линии трансформированных и опухолевых клеток, способных к длительному существованию вне организма. В контексте же рассматриваемых нами проблем более важно определиться с подходом к исследованию взаимосвязи старения и канцерогенеза. Один из них, а именно изучение самого процесса появления опухолевых клеток в ходе старения нормальных клеточных культур (Witten, 1986), представляется наиболее естественным и потому предпочтительным

Апоптоз А2

Гибель клеток

ц

B

C

 (ПО-АО)

Малигнизация клеток

к

1

D

п

2

A

Этапы

I

II

III

Рис.11. Прогнозируемая динамика изменения  (ПО-АО) в клетках первичной культуры. 1, 2 – быстрый и постепенный соответственно перевод клеток в состояние

гипероксии

подходом. При установлении дисбаланса Δ (ПО – АО) в промежутке между Δ_К и Δ_Ц клетки могут подвергаться апоптозу типа А2 (см. п. 7.1.1).

Согласно теломерной теории, репликативное старение клеток, в том числе и в условиях in vitro, связано с укорочением теломер после каждого митоза, вплоть до некоторой минимальной длины, результатом чего является утрата такими клетками способности к делению (см. п. 1.4.3 и 1.4.4). Анализ известной литературы по этому вопросу показывает, что данный постулат в некоторых случаях не подтверждается. Примером тому служат исследования Кармана и соавт. (Carman et al., 1998), проведенные на диплоидных эмбриональных кле-тках сирийского хомячка (SHE). Эти клетки после 20-30 циклов удвоения прекращали пролиферацию, теряли способность вступать в S-фазу после стимуляции сывороткой. В то же время клетки SHE экспрессировали теломеразу в течение всего репликативного жизненного цикла, а средний размер теломер не уменьшался. Выходит, что in vitro клетки могут иногда стареть по механизмам, не связанным с потерей теломер.

Как представляется нам, в указанном случае свои коррективы вносят условия гипероксии в среде культивирования. Если в состоянии умеренно повышенного уровня АФК и пероксидация выполняют нередко позитивные функции, активируя отдельные этапы прохождения митогенного сигнала, реплика-ции, транскрипции и иных процессов (об этом говорилось в ряде предыдущих параграфов и упоминается в некоторых последующих), то в случае интенсивного окислительного стресса неизбежны и негативные последствия. Например, часть макромолекул, в том числе участвующих в митогенезе, может быть модифицирована, что, независимо от активности теломеразы и длины теломер, дол-жно ингибировать пролиферацию и/или индуцировать какие-то другие нарушения, вплоть до приводящих к гибели клеток.

Как бы там ни было, две причины старения клеток in vitro – накопление ошибок в условиях содержания их в культуре и укорочение теломер – остаются все же наиболее вероятными. Полагают, что в обоих случаях активируются системы белков р53 и Rb, а при нарушении их функции происходит трансформация клеток (Sherr, DePinho, 2000). В более общем плане нам видится следующее: в токсических гипероксических условиях культивирования норма-льные клетки, старея, претерпевают, скорее всего, апоптоз А1, а опухолевые клетки – апоптоз А2. В случае неполадок в механизме апоптоза первые подвергаются неопластической трансформации, вторые же – окислительному цитолизу (см. п. 7.1.1).

Дополнительной причиной, способствующей усилению процессов окислительной деструкции в клетках in vitro, может считаться и тепло, как постоянно действующий фактор окружающей среды. Действительно, с помощью высоко-чувствительного метода (описание его приводят авторы Брусков и др., 2001) было показано, что под действием тепла в водных растворах генерируются АФК. В результате тепловой активации растворенного в воде атмосферного О₂ протекает последовательность реакций

О₂ → ¹О₂ → О → НО₂˙ → Н₂О₂ → ОН˙.

Образующиеся АФК, по-видимому, и содействуют тепловому повреждению ДНК и других биологических молекул путём их «автоокисления».

Наконец, отметим еще один способ интенсификации процесса старения клеток в условиях in vitro с помощью процедуры аноксии – реоксигенации, результаты которой, по нашему мнению, наиболее выражено отражают суть кислородно-перекисной модели старения. Основу механизма старения в данном случае составляют два принципиальных эффекта: адаптивное сокращение (ослабление) митохондриальной базы в период аноксии или гипоксии (см. выше); значительное усиление ПОЛ и других процессов окислительной деструкции при последующей реоксигенации вследствие резкого повышения рО₂ (относительно состояния аноксии) и невозможности быстрой утилизации избыточного О₂ «аноксическими» митохондриями. Степень пероксидативного стресса и, сле-довательно, скорость старения клеток будут зависеть от длительности пребывания их в состоянии аноксии: чем продолжительнее этот период, тем лучше сможет адаптироваться митохондриальная база к низкому уровню рО₂ и тем значительнее будет урон клеток после устранения ишемии.

Примером реализации старения клеток по указанному «сценарию» может служить следующий факт. Гепатоциты, выделенные у крыс разного возраста, подвергали 2-часовой аноксии и 1-часовой реоксигенации. Установлено, что в реоксигенационной фазе гепатоциты продуцируют большое количество кислородных радикалов, ответственных за повреждение их мембран и за другие при-частные к старению структурно-функциональные изменения, причем старые клетки были чувствительнее к реперфузионной травме (Gasbarrini et al., 1998). Подобного рода факты рассматриваются нами и в главе 4 в связи с обсужде-нием механизма старения и «спонтанной» малигнизации клеток в культуре.