Подготовка клинического материала для пцр-диагностики. Подготовка мокроты и мочи для выделения днк

Перед началом работы следует ознакомиться с «Методическим рекомендациями» «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», подготовленными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва, 2006).

Для проведения анализа используется следующий клинический материал:

1. У женщин: соскобы (мазки) из уретры, цервикального канала, нижнего свода влагалища, осадок клеток первой порции утренней мочи, помещенные в 300 мкл транспортной среды (0,05% -ный азид натрия).

2. У мужчин: секрет предстательной железы -0,3 мл.

3. У детей: осадок клеток первой порции утренней мочи, мазок с конъюнктивы, помещенные в 300 мкл транспортной среды.

Техника взятия мокроты

Для получения слюнной жидкости или мокроты просим пациента прокашляться или собрать небольшую порцию слюны в ротовой полости. Слюну ровной струйкой спускают в стерильную одноразовую пробирку с крышкой (Рисунок 1). Женщин перед сдачей мокроты или слюны просят удалить губную помаду.

П одготовка мокроты и мочи для выделения ДНК

Мокрота: Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя готовый раствор «Муколизин» или приготовить следующий раствор Na₂HPO₄ – 77,4 mM, NaH₂PO₄ – 22,6mM, бета-МЭ- 99,4 mM, 5%-ный азид натрия в конечной концентрации 0,05%.В ёмкостьс мокротой добавляют «Муколизин» в соотношении 5:1 (5 частей «Муколизина» к 1 части мокроты). В процессе разжижения мокроты (20-30 мин.) емкость периодически встряхивается. Затем отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку на 1, 5 мл и центрифугируют при 8000 g (10000 об./мин) в течении 10 мин. В случае исследования на бактериальные агенты полностью удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуумного осасывателя с колбой-ловушкой, осадок ресуспендируют в фосфатном буфере, доводя общий объем пробы до 0,1 мл. При исследовании на наличие вирусных агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозольным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную микроцентрифужную пробирку объмом 1,5 мл.

Моча: Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в специальный стерильный сухой флакон или сухую стерильную пробирку.

Предварительная обработка. Взбалтывают флакон с мочей. Переносят 10-20 мл мочи в центрифужные пробирки объемом 20-40 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 10 мин при 10000g (12000 об./мин). Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют 500 мкл физиологического раствора, тщательно перемешивают содержимое на вортексе и центрифугируют 10 мин при 10000g (12000 об./мин). Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют супернатант. К осдку добавляют физиологический раствор до конечного объема 0,1 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе и используют для выделения ДНК.

Хранить клинический материал не более суток при температуре от 2 до 8⁰С и в течении года при температуре не выше минус 68⁰С. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

Техника взятия клинического материала для ПЦР диагностики урогенитальных инфекций в пробирки Проба-Рапид

Урогенитальные инфекции: Chlamydia trachomatis –хламидиоз; Candida albicans-кандидоз; Ureaplasma urealyticum – уриаплазмоз; Mycoplasma hominis –микоплазмоз; Gardnerella vaginalis – гарднереллез; Trichomonas vaginalis- трихомониас; Listeria monocytogenes-листериоз.

Внимание! Пробирки без материала хранятся на +4⁰С (не подвергать заморозке)

Пробирки с клиническим материалом можно хранить в течение суток при +4⁰С, свыше суток при -20⁰С. Повторное замораживание-оттаивание не допускается.

Обратите внимание, что пробирки с транспортировочной средой (первичные пробирки) необходимо маркировать ДО взятия клинического материала.

Взятие материала рекомендуется проводить в период клинических проявлений или после алиментарной провокации, а также у женщин в середине или в 1-ый день овариального цикла.

Соскобы из цервикального канала. Перед взятием мазка необходимо удалить избыток слизи из эндоцервикса ватным тампоном, после чего вращательным движением универсального зонда собирают материал, избегая соприкосновения со стенками влагалища.

Соскобы из влагалища. Вращательным движением универсального зонда собирают материал со стенок влагалища.

Соскобы из уретры. Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-го часа перед взятием мазка. Соскоб эпителиальных клеток берут стерильным зондом с дакроновой щеточкой, который вводят в уретру на глубину от 2 до -4 см (у мужчин). Вращательным движением зонда собирают эпителиальные клетки.

Содержимое везику, пустул язв. Собирают стерильным зондом с ватным или с дакроновым тампоном.

Рисунок 2. Техника взятия крови

Собранный материал переносят в пробирку на 1,5 мл с 500 мкл транспортировочной средой. Зонд энергично вращают, затем удаляют, отжимая о стенки пробирки. Пробирку тщательно закрывают и переносят на хранение.

Техника взятия крови для ПЦР диагностики

Цельная кровь (Рисунок 2). Взятие крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 2 мл или специальную вакуумную систему типа "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuett©" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА). При взятии в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!

Пробирка закрывается крышкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Хранение взятого материала. При комнатной температуре - не более 6 часов. Холодильник 2-8 °С - не более суток. Не замораживать!

Транспортировка. Срочная транспортировка в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе

Предобработка проб. Не требуется.

Плазма крови. Взятие крови производится как описано выше в разделе "Цельная кровь".

Хранение взятого материала. При комнатной температуре - не более 6 часов. Холодильник 2-8 °С - не более суток. Не замораживать!

Транспортировка. Срочная транспортировка в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе.

Предобработка проб. Плазму крови получают центрифугированием цельной крови при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Затем отбирают плазму отдельными наконечниками с аэрозольным барьером в стерильные пробирки типа "Эппендорф" на 1,5 мл.

При исследовании на T.pallidum плазму дополнительно концентрируют центрифугированием при 13000 g в течение 10 минут. После центрифугирования супернатант удаляют отдельными наконечниками, используя вакуумный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости, и оставляют 0,1 мл для последующего выделения ДНК.

Хранение предварительно обработанных проб в холодильнике при Т 2-8°С - не более суток. Холодильник минус 20°С - до 1-го месяца. Холодильник минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.(поэтому образец плазмы для длительного хранения желательно разаликвотить в отдельные стерильные пробирки).

Обезвреживание клинического материала

Обезвреживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) в специальные контейнеры, содержащие 0,2% раствор ДП-2Т.

Меры предосторожности

Подготовка клинического материала для ПЦР-диагностики проводится в ЗОНЕ 1 (Рисунок 3, 4, 5).

ЗОНА 1. Бокс с предбоксником для проведения первичного разбора образцов, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение ДНК из клинического материала.

1. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) сбрасывать в специальные контейнеры, содержащие 0,2% раствор ДП-2Т.

2. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного бокса в другой. Запрещается перемещение персонала из одного бокса в другой, не сменив обувь, специальную одежду, маски, перчатки.

3. Поверхности столов, а также помещения, в которых производится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению.