- •Перечень сокращений
- •Оглавление
- •Введение
- •Подготовка клинического материала для пцр-диагностики. Подготовка мокроты и мочи для выделения днк
- •Практическое занятие № 1
- •Пцр диагностика. Пробоподготовка
- •Практическое занятие № 2
- •Практическое занятие №3
- •Практическое занятие №4
- •Практическая работа №5
- •Практическая работа №6
- •Пцр в реальном времени
- •Детекция продуктов амплификации.
- •1. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- •2. Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons).
- •3. Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay).
- •4. Использование интеркалирующих агентов.
- •Кривые плавления
- •Практическая работа №7
- •Практическая работа №8
- •Пцр в диагностике гепатитов
- •Практическая работа №9
- •Практическая работа № 10
- •Типовые комплектации пцр-лаборатории Комплектация лаборатории №1 Real-time
- •Комплектация лаборатории №2
- •Список литературы
Практическая работа № 10
Тема: Реакция обратной транскрипции
Цель: Освоить методику постановки обратной транскрипции для получения кДНК
Задачи:
Подготовить стерильную посуду для постановки реакции
Используя полученный РНК образец провести реакцию обратной транскрипции
Используя кДНК поставить амплификацию для накопления кДНК гепатита С
Ход работы:
Материалы и оборудование
Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым от компьютера управлением
ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»
Микроцентрифуга-вортекс FV-2400
Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)
Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл) Обратная транскриптаза
ОТ-буфер
Праймеры ОТ + дНТФ
Для проведения нескольких (N) реакций приготовьте ОТ-смесь: 2x(N + l) мкл ОТ-буфера, lx(N-H) мкл праймеров ОТ+дНТФ и 0,5x(N + l) мкл обратной транскриптазы.
Добавьте 3,5 мкл ОТ-смеси в пробирку с 16,5 мкл выделенной РНК и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.
Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек.
Термостатируйте пробирку в течение 30 мин при 40°С, а затем 5 мин при 95°С.
Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек.
Препарат ДНК готов к внесению в реакционную смесь для амплификации. Полученный препарат кДНК можно хранить в течение 6 месяцев при -20 С.
Препарат кДНК готов для внесения в реакционную смесь для амплификаци.
Для каждого генотипа промаркируйте по одной пробирке с запечатанной парафином реакционной смесью для отрицательных (ОК) и положительных (ПК) контрольных образцов.
Для каждого препарата кДНК промаркируйте по б пробирок с запечатанной парафином реакционной смесью.
По количеству промаркированных пробирок (N), включая положительные и отрицательные контрольные образцы, приготовьте смесь ПЦР-буфера с Taq-полимеразой: 10x(N + l) мкл ПЦР-буфера и 0,5x(N + l) мкл Taq-полимеразы.
В каждую промаркированную пробирку внесите по 10 мкл смеси ПЦР-буфера с Taq-полимеразой.
В каждую промаркированную пробирку внесите по 20 мкл минерального масла (приблизительно 1 капля из наконечника на 200 мкл).
В каждую промаркированную пробирку внесите по 5 мкл соответствующего препарата кДНК, отрицательного или положительного контрольного образца.
Примечание. Чтобы избежать повреждения парафинового слоя масло, препараты кДНК, ПК и ОК рекомендуется наносить на внутреннюю стенку пробирки.
Осадите капли со стенок пробирок центрифугированием в течение 1-3 сек при 3-5 тыс. об. /сек.
Поместите пробирки с подготовленной реакционной смесью в амплификатор. Для проведения амплификации используйте программу, приведенную в табл. 1.
Проведение детекции и учет результатов ПЦР
По окончании реакции амплификации результаты анализируют методом горизонтального гель-электрофореза (см. инструкцию к комплекту реагентов для детекции продуктов ПЦР методом гель-электрофореза).
Продукт амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в виде светящейся полосы ДНК красно-оранжевого цвета.
Таблица 11
Для амплификаторов с активным регулированием |
Для амплификаторов без активного регулирования |
|
||
Температура |
Время |
Температура |
Время |
Кол-во повторов |
94°С |
1 мин 30 сек |
94°С |
1 мин 30 сек |
1 |
94°С 64°С 72°С |
20сек 5 сек 5 сек |
94°С 64°С 72°С |
50сек 50сек 50сек |
10 |
94°С 64°С 72°С |
5 сек 5 сек 5 сек |
95°С 64°С 72°С |
50сек 50сек 50сек |
35 |
10°С |
хранение |
10°С |
Хранение |
|
1. В пробирках, маркированных как положительные контроли (ПК), должна быть видна светящаяся полоса красно-оранжевого цвета, содержащая фрагменты ДНК определенного генотипа HCV соответствующего размера (таблица 2). Помимо этого в ПК может присутствовать светящаяся полоса внутреннего контроля (ВК), соответствующая 900 п.о.
Таблица 12
|
Генотип HCV |
Длина продукта амплификации, п.о. |
HCV |
общий |
153 |
|
1а |
278 |
|
lb |
215 |
|
2а |
262 |
|
2Ь |
371 |
|
3 |
212 |
ВК |
|
900 |
2. В пробирках, маркированных ОК, должна присутствовать одна светящаяся полоса красно-оранжевого цвета размером 900 п.о., соответствующая ВК. Наличие полосы красно-оранжевого цвета размером, соответствующим продукту амплификации для данного генотипа, свидетельствует о контаминации. В этом случае результаты реакции признают недостоверными.
В исследуемых пробирках, в которых образовался только продукт амплификации ВК, результат реакции признают отрицательным. Если продукт амплификации ВК не образовался, результат реакции признают недостоверным.
При наличии светящейся полосы красно-оранжевого цвета на уровне положительного контрольного образца результат реакции признают положительным. В этом случае наличие или отсутствие светящейся полосы ВК, в учет не принимают.
Наличие светящихся полос, не соответствующих по электрофоретической подвижности ПК или ВК, рассматривается как отрицательный результат и является следствием неспецифической амплификации или контаминации.
Необходимо учитывать, что для вируса гепатита С характерен высокий полиморфизм, обуславливающий большое разнообразие генотипов, субтипов и вариаций. Помимо предложенных в данном наборе могут встречаться смешанные или другие генотипы. Надежным критерием получения достоверного результата является выявление РНК вируса гепатита С, которое при отсутствии положительных результатов с генотипирующими праймерами свидетельствует о наличии редкого генотипа.
Приложение 1.