2 Экспериментальная часть
2.1 Материалы и методы исследований
Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии ФГБОУ ВО Пензенского ГАУ. В экспериментах использовали по одному штамму шампиньона двуспорового и вешенки устричной, выделенные из плодовых тел, приобретенных в торговой сети г. Пензы.
Штамм шампиньона двуспорового Agaricus bisporus(J.E. Lange) Imbach – на питательной среде культура образует колонию перистого типа [40]со средне развитым воздушным мицелием (рис.3).
Штамм вешенки устричной Pleorotus ostreatus (Fr.) Kumm. - на агаризованной питательной среде образует шелковистую колонию [40]. Можно отметить радиальные тяжи с параллельными гифами. Край неровный. Воздушный мицелий высокий, достигает наибольшей плотности в центре колонии (рис.3).
а |
б |
Рисунок 3 – Маточные культуры шампиньона (а) и вешенки (б),
выделенные из плодовых тел
Для получения маточной культуры плодовое тело осторожно очищают от растительных остатков, прилипшей почвы, затем промывают в проточной и стерильной воде. Дают высохнуть на фильтровальной бумаге. Промывка плодовых тел не должна занимать много времени, так как в ином случае плодовые тела напитаются водой. Следующий шаг стерилизация. Стерилизовать можно, обтирая 96-градусным спиртом или погружая на несколько секунд в 1%-ный раствор сулемы, 3%- ный раствор перекиси водорода, раствор формалина (1 : 300).В последнем случае плодовое тело следует тщательно промыть и высушить. Плодовое тело можно также быстро обжечь над пламенем горелки. [23]
Обработанное плодовое тело разламывают, затем скальпелем, ланцетом или копьем переносят небольшую часть ткани из середины тела в питательную среду. Инокулюм нельзя обжигать в пламени горелки. Выделение культуры производят из разных частей плодового тела — шляпки, ножки, места перехода шляпки в ножку, гимениального слоя. Выбор участка ткани зависит от размеров и строения плодового тела, лучшим выбором будет самая толстая его часть. Выделение проводят, когда плодовое тело молодое и шляпка не развернута или затянута снизу покрывалом; у болетальных грибов — пока трубочки гименофора еще закрыты. Целесообразнее отбирать внутренние, стерильные части грибной ткани крупных размеров. В этом случае выделение будет происходить более успешно. [16]
Части плодового тела помещают в специальные емкости с питательной средой. Во избежание загрязнения в одну емкость помещают только один кусочек плодового тела. Части гриба помещают сверху на агар или частично погружают в агаризованную среду. Если культура выделяется плохо, то её инокулюм следует на несколько дней поместить в чашку Петри на смоченную стерильной водой фильтровальную бумагу. Инокулюм должен покрыться мицелием в таких условиях, и если это произошло, то его переносят на питательную среду.
Чашки или пробирки с инокулюмом помещают в термостат при 20–25°С. При более высокой температуре замедляется скорость выделения. В жаркое время года инокулюм помещают в холодильную камеру при температуре +4-10оС на 1-2 дня, затем переносят в термостат. Для успешного выделения влажность должна быть не ниже 80%, поэтому в термостат можно поставить сосуд с водой. [3]
Молодой растущий мицелий появляется на кусочках плодовых тел у разных видов в разные сроки: от нескольких дней до 3–4 недель. Важно не допустить высыхания плодового тела, поэтому если срок появления мицелия у вида большой, то части гриба следует сразу поместить в пробирку или заклеить чашки пластырем.
Выделение культур производят обычно на твердую среду: сусло-агар, солодовый агар, картофельно-глюкозный агар, мальц-агар и т. д. Если выделение идет плохо или мицелий не переходит с инокулюма на поверхность среды, в состав последней следует добавить дрожжевой автолизат, отвары коры, хвои или листьев различных высших растений (обычно в количестве от 0,1 до 5%), экстракты из плодовых тел грибов (4–5%). [20]
Для выделения чистых культур базидиомицетов можно использовать также жидкие среды с набором витаминов и слабой концентрацией питательных веществ, раствор мальц-экстракта (0,8%). Жидкие среды бывают эффективны в тех случаях, когда не удается выделить культуру на агаризованную среду [14].
В нашей работе в качестве питательных сред для выращивания мицелиальных культур использовались следующие стандартные среды:
Картофельно-глюкозный агар (КГА). Для приготовления названной среды используется только свежий, остывший до комнатной температуры, отвар картофеля. Глюкоза, (3% от объема среды) и агар-агар в том в количестве вносятся в колбу с отваром, после чего среда подвергается стерилизации в автоклаве при температуре 120°С и давлении 1 атм. в течение 30 мин. После стерилизации среда охлаждается до 60°С и разливается над пламенем горелки по 20 мл в стерильные чашки Петри. После полного застывания при комнатной температуре чашки с питательной средой готовы к использованию. Однако, для проверки качества стерилизации, 2–3 чашки от приготовленной партии лучше выдержать в термостате при температуре 37°С в течение суток. Питательную среду можно использовать, если по истечению этого периода времени на инкубированных чашках не будет отмечено роста контаминантной микрофлоры.
Пшеничный агар: 250 г зерен пшеницы мыли, заливали 1000 мл воды и отваривали в течение 30 минут, после закипания воды. Давали отвару постоять 5-10 мин, затем фильтровали, добавляли 20 гагара и стерилизовали при 1 атмосфере 15 - 20 минут.
Сусло-агар: обычное сусло (полученный на пивоваренном заводе содержит 10–15% сахара). Сусло фильтровали и разбавляли так, чтобы сахара содержалось около 7%. Затем добавили агар (20,0 г на 1000,0 мл) стерилизовали при 1 атмосфере 30 минут. В горячем виде разливали в пробирки [3,16].
Приготовленные среды разливают в пробирки (20 х 200 мм) по 10 мл. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. В чашки Петри наливают по 15 мл среды, равномерно распределяют ее по дну чашки. Стерилизовали все среды при температуре 110ºС в течение 20–30 минут [16].
В качестве органических субстратов использовали: пшеничную солому, лузгу подсолнечника, опилки. Перечисленные субстраты, заливали кипящей водой. Настаивали в течение 1 часа. Затем воду сливали, частично отжимали субстраты и наполняли пробирки. Стерилизацию проводили при 1 атмосфере в течение 30–40 минут. Пробирки с опилками стерилизовали дробно 3 раза по 10 минут при температуре 90–80ºС [5,21].
В качестве витаминной добавки использовали тиамин хлорид (витамин В1). Стерильный раствор витамина 0,05мг/мл вносили в 250мл агаризованной среды после стерилизации и частичного остывания [28].
В органические субстраты растворы витаминов также вносили после стерилизации, чтобы избежать их разрушения при высокой температуре. Для этого делали раствор витамина в стерильной воде в концентрации 0,02% и добавляли по 0,5 мл в каждую пробирку. Затем пробирки встряхивали и проводили инокуляцию мицелием.
На питательных средах учитывали скорость роста мицелия путем измерения диаметра колонии с пересчетом на число суток культивирования.
Методы стерилизации, используемые в микологических исследованиях, можно разделить на физические (обработка теплом, лучистой энергией, фильтрованием), химические (обработка различными химикатами), холодные (обработка различными излучениями, химическими веществами, фильтрование) и горячие (обработка теплотой) [16]
Тепловая стерилизация связана с прокаливанием на огне, фломбированием, кипячением, стерилизацией текучим паром, паром под давлением и при разряжении (низкотемпературный пар). Мы использовали стерилизацию в автоклаве. Режим автоклавирования зависел от вида среды.
К физическим методам относится стерилизация облучением. Инфракрасным, ультрафиолетовым, рентгеновым излучениями достигаются бактерицидный и стерилизующий эффекты. При подготовке помещения к пересадке культур и закладке опытов использовали кварцевые лампы [28]
Математическая обработка данных проводилась по общепринятой методике, а также использовали компьютерную обработку данных на IBMPC/AT–486, по программе составленной по методике Б.А. Доспехова [13].