2.2. Физико-химическая оценка

Гистологическое исследование экспериментального образца проводили согласно ГОСТ 19496-93 «Мясо. Метод гистологического исследования».

Для проведения гистологического исследования из фиксированных образцов вырезают кусочки мяса размером 15х15х4 мм таким образом, чтобы в него вошли поверхность разруба, распила или разреза, наружная поверхность туши (полутуши, четвертины, отруба, куска мяса) и все нижележащие ткани на глубину 15 мм. Ускоренной фиксации подвергают образцы при проведении экспресс-анализа, который позволяет получить результаты в течение 1 ч.

При проведении экспресс-анализа перед фиксацией из каждого отобранного образца вырезают кусочки мяса. Вырезанные кусочки мяса помещают в небольшую колбу или широкогорлую пробирку, заливают 4-5 объемами 10%-ного раствора нейтрального формалина и подогревают, не доводя до кипения, на пламени горелки. При появлении пузырьков воздуха подогрев прекращают, содержимое осторожно встряхивают и снова подогревают до появления пузырьков воздуха. Так повторяют 3-4 раза.

Зафиксированные кусочки мяса помещают в колбочку (стакан) и через вставленную в нее стеклянную воронку промывают холодной проточной водой в течение 2 мин. Промытые кусочки мяса режут на замораживающем микротоме в плоскости, параллельной продольной оси волокон, получая срезы толщиной 15-30 мкм.

С микротомного ножа с помощью кисточки срезы переносят в кристаллизационную чашку с водопроводной водой на несколько секунд для их распрямления. Под неповрежденный срез быстро подводят предметное стекло, обработанное яичным белком с глицерином. Срез извлекают из воды на середину стекла, удерживая его там препаровальной иглой. Затем срез накрывают сухой фильтровальной бумагой (3-4 слоя) и, прижимая бумагу ребром ладони, наклеивают его на предметное стекло. После снятия фильтровальной бумаги срез должен быть неповрежденным.

Накленные таким образом срезы окрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха в течение 3-4 мин и промывают 2 мин в воде. Для удаления избытка гематоксилина срезы опускают в раствор соляной кислоты до появления розовой окраски, затем помещают в аммиачную воду с целью нейтрализации соляной кислоты до появления синего окрашивания с последующей промывкой их в воде в течение 2 мин. Срезы докрашивают водным раствором эозина в течение 1 мин и ополаскивают в воде. Затем срезы обезвоживают двумя порциями этилового спирта, последовательно погружая их в каждую порцию на 1 мин. Просветляют срезы в карбоксилоле и отмывают в ксилоле, выдерживая в каждом по 1 мин. Подготовленные таким образом срезы заключают в полистирол, пихтовый или канадский бальзам под покровное стекло.

Подготовленные гистологические препараты рассматривают под микроскопом сначала при малом увеличении объектива 10 , а затем при среднем - 40 .

Степень свежести мяса определяют по показателям, указанным в таблице1.

Таблица 1

Наиме- нование показателя	Микроструктурная характеристика мяса
	свежего	свежего, не подлежащего длительному хранению	сомнительной свежести	несвежего
Состояние структуры ядер мышечных волокон	Структура четко выражена, окраска хорошая, равномерная	Структура неразличима. Изменение ядер мышечных волокон может распространиться на глубину до 3 мм от поверхности мяса, окраска хорошая, равномерная	Ядра мышечных волокон в состоянии распада-растворения, их окраска неравномерная, слабая, теневидная	Почти полное исчезновение ядер, окраска отсутствует или едва различима
Состояние поперечной и продольной исчерчен- ности мышечных волокон	Исчерченность ясно и четко выражена, окраска хорошая, равномерная	Исчерченность мышечных волокон ясно и четко выражена, окраска хорошая, равномерная	Исчерченность мышечных волокон слабо различима. Изменение мышечных волокон распространяется на глубину до 15 мм от поверхности мяса. Окраска понижена и неравномерная. Ослизненные участки поверхности мяса принимают темно-фиолетовую окраску (базофильную)	Полное исчезновение исчерченности мышечных волокон. Изменение мышечных волокон распространяется на глубину до 30 мм и больше от поверхности мяса. Окраска отсутствует или едва различима. Поверхность мяса принимает темно-фиолетовую окраску (базофильную)
Лока- лизация микро- флоры и границы ее распростра- нения	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций могут встречаться отдельные очажки кокковой микрофлоры	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций в перимизии и эндомизии наличие кокковой и палочковидной микрофлоры в виде множественных очажков и диффузных наложений, распространившихся на глубину до 3 мм от поверхности мяса	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций в перимизии и эндомизии наличие кокковой и палочковидной микрофлоры в виде множественных очажков и диффузных наложений, распространившихся на глубину до 5 мм от поверхности мяса	На всей поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций в перимизии и эндомизии диффузные наложения преимущественно палочковидной микрофлоры, распространившейся на глубину до 10 мм от поверхности мяса
Микро- картина структурных изменений мяса
- микрофлора;   - мышечные волокна;   - ядра;   - прослойка рыхлой соединительной ткани.

Степень (этапы) созревания мяса определяют по: интенсивности аутолитического распада мышечных волокон на фрагменты; разволокнению фрагментов на микрофибриллы и их распаду на саркомеры в виде зернистой массы, заключенной в эндомизий; сохранению восприятия к окраске составных элементов волокна. [1]

Микроструктурные характеристики мяса в зависимости от степени созревания приведены в таблице 2.

Таблица 2

Этапы созревания мяса	Микроструктурная характеристика	Микрокартина структурных изменений мяса
1	В срезах мяса обнаруживаются поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментации отдельных мышечных волокон при сохранении во фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности
2	В срезах мяса обнаруживаются множественные поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментации многих мышечных волокон при сохранении во фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности
3	В срезах мяса обнаруживается распад отдельных фрагментов на миофибриллы, а миофибрилл - на саркомеры в виде зернистой массы, заключенной в эндомизий
- поперечно-щелевидные нарушения мышечных волокон;   - фрагментация мышечных волокон;   - мелкозернистая белковая масса;   - ядра;   - мышечные волокна.

Содержание тяжелых металлов определяли по ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомноабсорбционный метод определения токсичных элементов». Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье и продукты и устанавливает метод определения свинца, кадмия, меди, цинка и железа.

Метод основан на минерализации продукта способом сухого или мокрого озоления и определении концентрации элемента в растворе минерализата методом пламенной атомной абсорбции.

Распыляя в пламя нулевой стандарт (при использовании концентрирования - его экстракт), устанавливают показания прибора на нуль. Затем в порядке возрастания концентрации измеряют абсорбцию стандартных растворов сравнения (или их экстрактов). В конце градуировки отмечают положение нулевой линии при распылении нулевого стандарта.

Измеряют абсорбцию небольшого числа (5-10) испытуемых и контрольных растворов, промывая после каждого измерения систему распылителя и горелки дистиллированной водой или нулевым стандартом (для экстрактов - эфиром) до возвращения сигнала к показаниям, близким к нулю. Повторяют точное измерение абсорбции нулевого стандарта и одного из стандартов сравнения, наиболее близкого по концентрации к испытуемым растворам. Если при этом не отмечается заметного смещения нулевой линии и изменения абсорбции стандарта, продолжают измерения абсорбции испытуемых растворов, периодически повторяя контроль дрейфа нуля и чувствительности и заканчивая измерения полной градуировкой.

Измерение абсорбции каждого раствора проводится не менее 2 раз.

После окончания измерений абсорбции полной серии испытуемых растворов проводят 20-кратное измерение абсорбции стандартного раствора с минимальной концентрацией или любого испытуемого раствора, или смеси остатков растворов с низкой концентрацией элемента. В зависимости от наличия дрейфа измерения проводят по 6.2 или по 6.3 - по той же методике, что и для испытуемых растворов. На основе полученной статистики рассчитывают стандартное (среднее квадратическое) отклонение от среднего значения для единичного измерения  , мкг/см . Утроенное значение стандартного отклонения 3  считается пределом обнаружения элемента в растворе при  =0,99.

Если в проведенной серии измерений присутствует не менее 10 растворов с концентрацией элемента ниже 0,2 мкг/см , специальные измерения не проводят, а рассчитывают стандартное отклонение по формуле

,

где   - расхождение параллельных измерений концентрации элемента в i-м растворе;   k - количество растворов.

Массовую долю элемента в пробе, млн , рассчитывают по формуле

,

Если разность   оказывается меньше предела обнаружения 3 , то дается односторонняя оценка максимально возможной концентрации элемента в продукте в млн

,

За окончательный результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака. [2]

Допускаемое расхождение между двумя параллельными результатами, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость  ), зависит от массовой доли элемента в продукте и при  0,95 не должно превышать значений, указанных в таблице 3.

Таблица 3

Элемент		Массовая доля элемента в продукте  , млн		Сходимость  , млн		Относительное стандартное отклонение сходимости 100 , %
Свинец		0,01		0,0050		18
		0,1		0,025		9
		0,5		0,081		6
		1,0		0,130		5
Кадмий		0,01		0,0034		12
		0,1		0,017		6
		0,5		0,055		4
		1,0		0,090		3
	Медь		0,5 1,0 10 30		0,22 0,31 0,76 1,2		16 11 3
							1
	Цинк		1,0 10 50 100		0,34 2,4 9,6 17		12 9 7
							6
	Железо		10 50 100 200		3,8 9,3 14 20		13 7 5
							4

Определение водорастворимых витаминов осуществляется по ГОСТ Р 55482-2013. Метод основан на экстракции водорастворимых витаминов путем последовательного проведения кислотного и ферментативного гидролиза, осаждении белков и количественном определении витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в ультрафиолетовой (УФ) области спектра с заданной длиной волны.

Полученные результаты в виде пиков на хроматограмме сопоставляют с пиками стандартных образцов с заведомо известными концентрациями.

Условия проведения хроматографического анализа подбирают в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.

Массовую долю каждого витамина в продукте  , мг/кг, рассчитывают по формуле

 ,   

где C_ct - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мг/см ;

S_x - площадь пика витамина в анализируемой пробе, усл. ед. (см. 6.3.4);

V_p - площадь пика индивидуального витамина в градуировочном растворе, усл. ед.;

S_ct - объем раствора для пробоподготовки (сумма объемов раствора для гидролиза, раствора для осаждения белков и раствора для доведения рН до необходимого значения), см ;

m - масса анализируемой пробы, г;

1000 - коэффициент перевода массы анализируемой пробы (г в кг).

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака.

Расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, не должно превышать предела повторяемости (сходимости),  , значения которого приведены в таблице 5. [5]

Таблица 5

Наименование определяемого компонента	Диапазон измеряемых массовых концентраций, мг/кг	Границы относительной погрешности,  , %	Предел повторяемости,  , мг/кг	Предел воспроизводимости,  , мг/кг
Витамин	0,5-20,0	18	0,15	0,30
Витамин	0,5-20,0	35	0,3	0,45
Витамин	5,0-100,0	20	0,15	0,30
Витамин	5,0-100,0	20	0,3	0,45
Витамин	0,5-20,0	25	0,2	0,30
Витамин	0,01-5,0	34	0,30	0,45
Витамин C	10,0-500,0	23	0,15	0,30
Витамин H	0,01-5,0	20	0,15	0,30
- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/кг;  - среднеарифметическое значение результатов двух отдельных определений, выполненных в разных лабораториях, мг/кг.