5.2. Обработка хроматограмм
Качественный анализ (идентификацию) проводят следующими способами:
- по времени (или объему) удерживания, сравнивают времена удерживания идентифицируемого компонента и известного вещества, проанализированного в тех же условиях;
- при помощи веществ-тестеров; эталонный компонент, наличие которого предполагается в смеси, добавляют к пробе, увеличение соответствующих пиков указывает на присутствие того или иного компонента;
- по табличным данным: исследуемую смесь разделяют на колонке при условиях, указанных в справочной таблице, и на основе полученной хроматограммы идентифицируют отдельные компоненты.
Качественный анализ разделенной в хроматографической колонке смеси основан на характеристиках удерживания и других аналитических приемах. На выходе из колонки компоненты смеси проходят детектор в виде хроматограммы, которая является основой качественного и количественного анализа. Вымываемые из колонки компоненты могут быть направлены также в анализатор, где происходит детектирование химическим или физическим методами.
Время удерживания и пропорциональный ему удерживаемый объем служат основой идентификации, поскольку определяются свойствами системы сорбент - сорбат. Для качественной характеристики применяются абсолютные и относительные величины. Так, абсолютное время удерживания компонента tM (время от ввода пробы до появления на хроматограмме максимума пика) при неизменных условиях (температура и давление газа-носителя) является постоянным, возможные изменения условий отражаются на величине tM. Применение относительного времени удерживания исключает влияние случайных факторов и обеспечивает воспроизводимые результаты. При этом находят отношение абсолютного времени удерживания идентифицируемого вещества (стандарта) и полученного в одинаковых условиях.
Для качественного анализа часто применяют метод тестеров. Время удерживания отдельных соединений сравнивают со временем удерживания хроматографически чистых веществ при исследовании в тех же условиях. Совпадение времени удерживания анализируемого соединения и тестера свидетельствует об их идентичности.
Второй способ состоит в том, что предполагаемый компонент добавляют в исследуемую смесь при повторном анализе, при котором площадь хроматографического пика увеличивается.
В обоих способах для большей уверенности в получаемых результатах анализируют смесь на другой неподвижной фазе. Если при этом не наблюдаются различия во времени удерживания определяемого соединения и тестера, то эти вещества с большой вероятностью можно считать идентичными.
Количественная обработка хроматограмм основана на измерении площадей пиков или их высот при условии симметричности пиков. Для вычисления концентрации вещества в пробе применяют следующие методы.
Метод абсолютной градуировки. В идентичных условиях хроматографирования получают пики стандартных растворов известной концентрации. Строят график зависимости площади (или высоты) пика от количества введенного стандарта. Далее находят эти характеристики пиков в анализируемой смеси и по градуировочному графику вычисляют концентрацию вещества. В качестве стандарта можно применять любое хроматографически чистое вещество, отвечающее требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту в данных условиях. Этот метод наиболее пригоден для поточного анализа.
Метод внутреннего стандарта предусматривает введение в анализируемый образец известного количества эталонного соединения, хроматографирование полученной смеси и расчет по формуле:
(5.6)
где Qi и Qст – параметры пиков анализируемого компонента и стандарта соответственно; r – отношение массы внутреннего стандарта к массе пробы.
В методе внутренней нормализации предполагается, что пики всех возможных компонентов смеси зафиксированы на хроматограмме, и сумма их площадей (S) равна 100 %. Различия в чувствительности детектора к разным компонентам учитывается введением поправочных коэффициентов (Ki). Расчет ведут по формуле:
(5.7)
где n - число компонентов смеси, S - площадь хроматографического пика, Ki - поправочные коэффициенты для каждого i-компонента.
Степень разделения двух компонентов характеризуется критерием разделения Rs:
Rs = 2(tR2-tR1) / (∆t2 +∆ t1), (5.8)
где tR2 и tR1 - время удерживания первого и второго компонентов; ∆t2 и ∆ t1 - ширина у основания хроматографических пиков первого и второго компонентов.
Степень разделения зависит от эффективности разделения, которая характеризуется числом теоретических тарелок N:
N=16(tR/∆t)2, N = L/H, (5.9)
где L - длина колонки; H - высота, эквивалентная теоретической тарелке.
Вычисления Rs и N проводят по хроматограмме. Малая величина Н и большая N - показатели высокой эффективности хроматографической колонки, то есть для быстрого установления равновесия между подвижной и неподвижной фазами адсорбент должен быть пористым и иметь частицы небольшого размера. Для уменьшения проскока элюента и устранения других факторов, приводящих к расширению хроматографических пиков, колонка должна быть достаточно длинной, равномерно и плотно упакованной: увеличение длины ведет к возрастанию числа теоретических тарелок, но одновременно повышает время разделения.