- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
Перед окончанием роста культуры отбирают 5 мл пробы (или больше) и добавляют к 5 мл смеси немеченых соединений, содержащей достаточное количество H2SO4, так чтобы конечный рН был равен 1,5—1,8. При этом происходит остановка реакции и перевод всех присутствующих в среде метаболитов в кислотную форму. Смесь немеченых соединений (при использовании Е. coli) содержит следующие компоненты, растворенные в основной ростовой среде: этанол, уксусную кислоту, пировиноградную кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту и лимонную кислоту. Ввиду малых количеств конечных продуктов в 5-10 мл культуральной среды использование смеси немеченых соединений существенно для получения количественного выхода радиоактивных конечных продуктов, образуемых клетками. Концентрация каждого компонента смеси равна 0,1 М, за исключением фумаровой кислоты, концентрация которой составляет 0,05 М. Смесь немеченых соединений вместе с культурой центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную жидкость отделяют и хранят до анализа в замороженном состоянии. При исследовании разных организмов требуется приготовление смесей различных немеченых соединений. Их состав, естественно, зависит от природы конечных продуктов, которые должны накапливаться в культуральной жидкости.
Негазообразные конечные продукты, присутствующие в 1 мл такой пробы, определяют с помощью хроматографии на кремневой кислоте.
1.2.5 Расчет и определение баланса
Подсчитав общую радиоактивность, связанную с каждым из описанных выше этапов, можно представить общую картину и определить некоторые метаболические пути, которые либо используются, либо не используются в данных условиях роста.
В конце периода роста бактерий вся исходная радиоактивность (Rисх) должна быть равна сумме радиоактивностей неиспользованного субстрата (SH), газообразных конечных продуктов (G), ассимилированного углерода (А) и негазообразных конечных продуктов (Е). Если это не соблюдается, то возможна какая-либо экспериментальная ошибка.
Общая радиоактивность, присутствующая в культуре в конце периода роста, равна сумме всех этих радиоактивностей, за исключением радиоактивности углерода в газообразных продуктах (Rисх-G или SH+A+E). Если все клетки удаляют центрифугированием в конце периода роста, то общая радиоактивность надосадочной фракции представляет собой лишь сумму радиоактивностей неиспользованного субстрата (SН) и негазообразных конечных продуктов (Е). Величина Е равна сумме всех веществ, элюированных из колонки с кремневой кислотой. Если это не так, то не исключено, что в растворе присутствует конечный продукт, не обнаруживаемый в указанных условиях.
Установив балансовые взаимоотношения и определив путь превращений углерода, можно сделать некоторые общие заключения, касающиеся биоэнергетических и биосинтетических путей метаболизма. Например, появление радиоактивности в клеточной фракции, не растворимой в горячей ТХУК, означает участие меченого субстрата в биосинтезе аминокислот или реакциях биосинтеза клеточных стенок. Природа образующихся газообразных и негазообразных конечных продуктов и их соотношение могут служить ключом к определению типов биоэнергетических путей, используемых в условиях роста, применявшихся в эксперименте. Проводя подобные исследования в изменяющихся условиях роста бактерий (в аэробных и анаэробных, на богатой и бедной среде, в присутствии и в отсутствие различных ингибиторов и т. д.), можно получить дополнительные сведения в этом отношении.