Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, тому побачити їх

неозброєним оком неможливо. У той же час морфологія мікробів, їх розміри, фор-

ма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня

ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою

класифікації. Зважаючи на це, одним з найважливіших методів дослідження будо-

ви мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів до-

слідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як

темнопольна, фазово-контрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна,

люмінесцентна та ін. При вивченні анатомії й ультраструктури вірусів використо-

вують електронну мікроскопію.

Сучасна промисловість випускає багато видів мікроскопів залежно від їх при-

значення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користують-

ся мікроскопами МБР-1, МБР-3 (рис. 1).

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До ме-

ханічної входять штатив, тубус, револьвер, предметний столик, макро- й мікрогвинт,

до оптичної – об’єктиви й окуляри, до освітлювальної – дзеркало й конденсор.

12 Частина і. Загальна мікробіологія

У верхній частині штатива

є тубус, в який вставляється оку-

ляр, а знизу він має револьвер, в

отвори якого вгвинчені 3-4 об’єк-

тиви. Обертаючи револьвер,

можна встановити будь-який

об’єктив під отвір тубуса. Остан-

ній підіймається і опускається за

допомогою макро- й мікромет-

ричного гвинтів. Для грубого на-

ведення зображення користують-

ся макрогвинтом. Більш точно

це робиться за допомогою мікро-

гвинта. Мікрометричний гвинт є

однією з найбільш тендітних ча-

стин мікроскопа й вимагає обе-

режного поводження з ним.

Предметний столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знахо-

диться отвір, над _c<02710262>Tяким розміщують предметне скло з препаратом (мазком). У більш

досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеці-

альних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикуляр-

них напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох

лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (.8, .40) та

імерсійні (.90, .120). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою

яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, у зв’язку з різницею

показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових

променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єкти-

ви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедро-

ва, персикова олія чи “імерсіол”, коефіцієнт заломлення світла яких такий самий,

як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переваж-

но імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна

здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі

роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена

такими явищами, як хроматична й сферична аберації, дифракція та ін. Якщо обидва

види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній сис-

темі і його усунути або принаймі зменшити практично неможливо. Дифракція в

значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вира-

хувати за формулою:

⋅ α

= λ

n sin

A 0,61 ,

Рис.1. Мікроскопи МБР-1 (а) і МБР-3 (б).

а б

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень 13

де А – роздільна здатність; 0,61 – коефіцієнт геометричних величин при ви-

рахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; λ – довжина світло-

вої хвилі; n· sinα – постійна величина для кожного об’єктива, яка називається чис-

ловою або нумеричною апертурою. У сучасних сухих об’єктивах вона не пере-

більшує 0,95, а в імерсійних – від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані

на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх

нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним

об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність

дорівнює:

0,2мкм

1,60

A = 0,610,55 =

Отже, при користуванні навіть найкращими імерсійними об’єктивами немож-

ливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення

об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів.

Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при вико-

ристанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить

від об’єктива, не додаючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими

збільшеннями: .7, .10, .15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається

із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в кон-

денсор, а через нього – в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала увігнутий, дру-

гий – плоский. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише

плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка

променів в одній точці (фокус), яка знаходиться в площині досліджуваного препа-

рату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня

предметного столика, з штучним – опускати доти, поки зображення джерела світла

не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів

конденсор також опускають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діафрагмою, яка

знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно

до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при

відкритій, а незабарвлені – при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується

зображення та розширюються межі видимості. Перше досягнуто випуском мікро-

скопів-бінокулярів, друге – дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний

мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це

створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають

відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночас-

но досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших

клітин оптична промисловість випускає більш досконалі мікроскопи. Одним із них