Специфическая индикация

Специфическая индикация — это комплекс специальных ме­роприятий, проводимых для быстрого обнаружения патогенных бактерий, грибков, риккетсий, вирусов, бактериальных токсинов и определения их вида.

Ускоренное обнаружение и распознавание природы патоген­ных микроорганизмов и их ток­си­нов обеспечивает своевременное проведение общей и специфической экстренной профилактики, введение режимных мероприятий, а также проведение других профилактических и противоэпидемических мероприятий, направ­ленных на предупреждение возникновения и распространение ин­фекционных заболеваний. Для специфической индикации пато­генных микроорганизмов и ток­синов в нативном и обогащенном материале наиболее целесообразными оказались иммунолюминесцентный метод и реакция непрямой гемагглютинации.

По чувствительности, специфичности, воспроизводимости ре­зультатов, безопасности и быстроте проведения исследования они превосходят другие приемы микробиологического экспресс-анализа и дополняя друг друга, позволяют дать обоснованный по­ложительный ответ до выделения чистой культуры и ее полной идентификации.

Вся работа по специфической индикации рассчитана на 48 ча­сов, а для обнаружения вирусов — 72 часа.

Специфическая индикация предусматривает отбор и транс­портировку проб в лабораторию, первичную обработку проб и накопление (обогащение) исходного материала и, наконец, обна­ружение и идентификацию возбудителя с помощью экспресс-анализа.

Пробы отбирают при положительном результате неспецифической индикации или при внезапном появлении у людей и животных острых инфекционных заболеваний.

Отбор материалов, наиболее подозрительных на содержание патогенных микроорганизмов или их токсинов, производят в оча­гах поражения и на этапах медицинской эвакуации лица, оде­тые в защит­ную одежду или полный противочумный костюм, с помощью специального воздухозаборника ме­дицинского набора для отбора проб (МНОП), комплексного пробоотборника (КПО-1) и прибора химической разведки (ПХР-МВ). Эти лица должны быть обучены отбору проб и вакцинированы про­тив наиболее опасных инфекционных болезней.

МНОП предназначен для отбора и упаковки проб из объек­тов внешней среды (кроме проб воздуха) и материалов от пора­женных людей. Набор включает технические средства, инстру­менты для отбора проб (ручной насос для отбора и фильтрации проб воды, марлевый сачок, резиновые перчатки, металличес­кий совок, скальпель, ножницы, анатомический и энтомологи­ческий пинцеты, трубки с угольным адсорбентом, фланелевый флажок-полотенце, пеножелатиновые и мембранные фильтры, стерильные полиэтиленовые пробки, пакеты и мешочки, флако­ны с клеем, физиологическим раствором, спиртом и дезинфици­рующими средствами, блокнот, карандаш, резиновые трубки, тесьма, печать «заражено» и т. д. и тару для упаковки (перенос­ной металлический футляр с ручкой) и транспортировки (рези­новый мешок).

КПО-1 также предназначен для отбора и упаковки проб из объектов внешней среды в очагах заражения химическими, ра­диоактивными веществами или патогенными микроорганизмами и является табельным средством. Комплект состоит из прибора для отбора проб из водозаборника (батометра). Прибор для отбора проб представляет собой коробку с набо­ром инструментов и материалов (пенал с пробирками, марлевый сачок, банки с крышками, полиэтиленовые мешки, нож, ножницы, пинцет, щуп, ложка, сверло, отборник проб почвы, пеножелатино­вые фильтры, вата, бинты и др.). Водозаборник включает в себя металлический цилиндр с дис­ком, резиновой пробкой и стальной канат. При заборе пробы диск опускают в воду на нужную глубину, а затем по канату опускают последовательно цилиндр и пробку. Заполненный водозаборник извлекают и выливают воду в банку.

Материалами для взятия проб служат:

— воздух из приземного слоя,

— осколки и содержимое боеприпасов,

— подозрительные капли жидкости и порошкообразные ве­щества,

— вода и снег,

— смывы с открытых поверхностей,

— насекомые, грызуны,

— материал от пораженных людей (животных) и их трупов.

Пробы пищевых продуктов и фуража берут только при пря­мом подозрении на заражение. Почва мало пригодна как объект исследования в связи с обильным загрязнением ее посто­ронней микрофлорой.

Упакованные пробы в полиэтиленовые пробирки, пакеты и ме­шочки помещают в резиновый мешок, плотно завязывают, опеча­тывают и пересылают в лабораторию нарочными в срок не более 2,5—3 часа с момента взятия проб, используя термоизоляцион­ный контейнер и все виды транспорта (самолет, вертолет, авто­мобиль).

В сопроводительной записке-направлении должны содер­жаться следующие данные: куда и кому направляется проба, название материала (пробы), место взятия пробы, время взя­тия пробы (месяц, число, время суток), основание для отбора проб (общие внешние признаки, результаты неспецифической индикации, появление больных и т. д.), цель исследования, долж­ность, звание, фамилия и подпись лица, производящего отбор проб, способ доставки материала в лабораторию; где, когда и как консервирован материал; время доставки материала в ла­бораторию (число, часы суток), должность, звание, фамилия и подпись лица, принявшего пробу.

После окончания работы лица, производившие отбор и транс­портировку проб, проходят полную санитарную обработку.

Для проведения специфической индикации приняты сокра­щенная и расширенная схемы исследования, основанные на еди­ных принципах и методах анализа. Различия между ними оп­ределяются целями и объемом работы.

Исследования проводятся с учетом обнаружения наиболее патогенных бактерий, риккетсий, вирусов, грибков, токсинов и в строгом соответствии с общей принципиальной схемой, преду­сматривающей обязательное выполнение следующих этапов ана­лиза:

— прием, регистрация, разбор и сортировка проб,

— первичная обработка и подготовка проб к исследованию,

— экспресс-анализ нативных материалов проб,

— ускоренный анализ биологически обогащенного мате­риала,

— оценки результатов анализа и выдача ответов.

Основными методами экспрессного (исследование нативных материалов проб) и ускоренного анализа (исследование биоло­гически обогащенного материала проб) являются иммунолюми-несцентный метод и реакция непрямой гемагглютинации.

Взаимно дополняя друг друга, эти методы позволяют выяв­лять и определять вид микроба или токсина в пробах в сроки 1—6 (предварительный ответ) до 14—48 (72) часов – окончатель­ный положительный или отрицательный ответ на этот период исследования. По окончании специфической индикации и при необходимости проведения контрольных и экстренных анализов, выделения чистой культуры и ее изучения, материалы пробы подвергаются дальнейшему анализу с применением приемов и методов классического исследования.

По сокращенной схеме индикации—анализ про­водят с учетом обнаружения в исследуемом материале возбу­дителей чумы сибирской язвы, холеры, ботулотоксина. По по­казаниям и в зависимости от конкретных условий работы лаборатории перечень биологических агентов, подлежащих исследованию по сокращенной схеме индикации, может быть изменен или дополнен. Принципиальный ход анализа при этом остается неизменным.

Исследования начинают с приема, регистрации и сортировки проб. Определяют очередность и порядок исследования достав­ленных проб. Выделяют пробы для исследования в нативном материале, увлажняют сухие пробы и переводят их в жидкую фазу.

Часть материала пробы отделяют и направляют в вышестоя­щую лабораторию для исследования по расширенной схеме. Из нативного, увлажненного материала и материала после физи­чес­ко­го концентрирования каждой пробы готовят по 8 мазков (мазков-отпечатков на 2-х предметных стеклах). После фикса­ции одно стекло каждой пары оставляют без обработки до конца исследования в качестве контрольного препарата. Мазки вторых препаратов окрашивают по прямому методу флюоресци­рующих антител с концентрированием фона специфическими люминесцирующими сыворотками в смеси с альбумином, меченым родамином: первый—люминесцирующими неспецифическими чумными антителами, второй — люминесцирующей поливалент­ной псевдотуберкулезной сывороткой, третий — люминесцирую­щей сибиреязвенной адсорбированной сывороткой (против веге­тативных форм), пятый — люминесцирующей холерной сыворот­кой.

Препараты после окраски хорошо промывают, высушивают и подвергают люминесцентной микроскопии.

Результаты экспресс-анализа нативных материалов пробы с помощью иммуно-люми­нес­цен­т­ного метода и РПГА позволяют лаборатории выдать предварительный ответ, при этом о наличии в пробе возбудителя чумы, сибирской язвы и холеры ответ мо­жет быть дан только при обнаружении их обоими методами.

Ускоренный анализ материалов после биологического обо­гащения предусматривает просмотр и исследование посевов, на­блюдение за животными и вскрытие павших, приготовление из них мазков, взвеси и их исследование теми же экспресс-метода­ми (иммуно-флюоресцентными, РПГА).

При индикации по расширенной схеме все поступающие в лабораторию пробы исследуют на наличие бактери­альных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа, мелиоидоза); возбудителей риккетсиозов (Ку-лихорадки, сыпного тифа, лихорадки Скалистых гор, лихорадки цуцугамуши); возбудителей вирусных заболеваний (арбовирусных инфекций группы А (венесуэльского и дру­гих энцефалитов лошадей) и В (вирусы комплекса клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки и др.), а также возбудителя пситтакоза возбудителей глубоких мико­зов (кокцидиомикоза, нокардиоза, гистоплазмоза) и токсина бо­тулизма.

Этот перечень биологических агентов, подлежащих исследо­ванию по расширенной схеме, при необходимости может быть из­менен или дополнен.

Принципиальная схема и порядок проведения анализа оста­ются при этом без изменения.

Иммуно-люминесцентный метод флюоресцирующих антител сочетает в себе специфичность иммунологического, достовер­ность морфологического и чувствительность люминесцентного анализа. В основе лежит серологическая реакция между анти­геном и гомологичным к нему флюоресцирующим антителом, представляющим собой гамма-глобулиновую фракцию иммунной сыворотки, химически соединенную с флюорохромом специаль­ным красителем, способным светиться в ультрафиолетовых или фиолетово-синих лучах. Флюоресцирующие антитела становятся таким образом своеобразными иммунохимическими индикато­рами на патогенные микроорганизмы.

Для исследования готовят препарат из объектов внешней среды, материалов от пораженных людей (животных) и из обога­щенных материалов. Мазки обрабатываются по прямому или не­прямому методу флюоресцирующих антител.

Прямой метод обработки заключается в непосредственном взаимодействии видоспецифичес­ких и группоспецифических флю­оресцирующих антител с гомологичными антигенами, фикси­рованными антигенами, фиксированными на стекле. Непрямой — в специфическом соединении антиглобулиновых флюоресцирую­щих антител с комплексом «антиген + нефлюоресцирующий им­мунный глобулин».

Различают две модификации непрямого метода: иммунолюминесцентную окраску сывороточных глобулинов (антиген + иммун­ный глобулин + флюоресцирующий антиглобулин) и иммунолюминесцентную окраску комплемента морской свинки (анти­ген + антитело + комплемент + флюоресцирующий антикомплиментарный глобулин).

Для индикации в качестве основного используют прямой ме­тод флюоресцирующих антител с контрастированием неспеци­фического свечения сывороточными глобулинами, меченными флюорохромами, которые дают контрольное по цвету свечение фона (гетерологичных микроорганизмов, клеточных элементов, посторонних частиц и т. д.).

Принцип реакции непрямой гемагглютинации состоит в том, что сенсибилизированные иммунными сыворотками эритроциты барана в присутствии антигена гомологичного антителам, адсор­бированным на поверхности эритроцитов, дают в реакции на стекле гемагглютинацию таких эритроцитов с просветлением жид­кости.

РНГА как адсорбционно-серологический метод экспрессного выявления патогенных микроорганизмов и токсинов в исследуе­мом материале по своей специфичности превосходит другие се­рологические реакции.