3. Анализ вторичной структуры молекул рРнк облегчает выравнивание (элайнмент) последовательностей

Особенность молекул рРНК состоит в том, что они формируют структуры второго порядка (на­пример, спирали) посредством внутримолекуляр­ных взаимодействий между комплементарными участками на различных расстояниях (рис. 1). Образование таких структур можно предсказать на основании координированных нуклеотидных замен в гомологичных позици­ях последовательностей из филогенетически раз­личающихся организмов. Предполагается, что структурное сходство указывает на консерватив­ную функцию. Вторичные структуры рассмат­ривают как доказательство родства, если ана­логичные, но различающиеся по нуклеотидпой последовательности участки рРНК филогенети­чески умеренно близких организмов формируют одинаковые или очень сходные вторичные струк­туры.

Молекулы 23S-рРНК содержат примерно 100 элементов вторичной структуры, молекулы 16S-рРНК — примерно 50 таких элементов. При ана­лизе 5'- и З'-половины двухцепочечных участков, а также внутренние или терминальные одноцепочечные петли можно рассматривать как гомоло­гичные элементы, которые можно выровнять да­же в том случае, если их первичные структуры различаются.

Достоверность филогенетических схем (дере­вьев), построенных на основе анализа последова­тельностей, существенно зависит от того, насколь­ко корректно произведено выравнивание последо­вательностей. Корректное выравнивание состоит в том, что обозначения только гомологичных нуклеотидов (т. е. остатков, происходящих из одной позиции в предковой последовательности) распо­лагают столбцами и затем путем сравнения опре­деляют последовательности как идентичные или различающиеся. Благодаря тому, что доля высококонсервативных позиций или даже участков в последовательностях рРНК довольно велика, про­цедура выравнивания этих участков не представ­ляет особой сложности (рис. 2). Однако часто в последовательностях обнаруживаются круп­ные делеции или вставки. Наиболее известным примером такого рода служит стабильная инсерция длиной примерно сто нуклеотидных остат­ков в молекуле 23S-рРНК у актиномицетов; уста­новлено также, что у некоторых представителей Proteobacteria отсутствует ее участок длиной при­мерно 80 н.

Рис. 2. Выравнивание (элайнмент) пяти гомологичных участков последовательности 16S-РНК (позиции 1220-1265 последовательности рРНК Escherichia coli); звездочками отмечены инвариантные позиции; цифры 2, 3 и 4 указывают позиции, инвариантные в 2, 3 или 4 последовательностях.

4. Алгоритмы для построения филогенетических деревьев

Филогенетические взаимоотношения организмов, установленные на основании сравнительного ана­лиза последовательностей, можно наглядно вы­разить графически. Такие деревья состоят из внутренних точек и терминальных точек (узлов), соединенных ребрами (ветвями). Для каждой па­ры узлов существует путь (серия точек, соединен­ных ветвями). Терминальные узлы представля­ют собой операционные таксономические единицы (ОТЕ), которыми в большинстве исследований являются анализируемые организ­мы. С помощью бескорневых деревьев наглядно изображаются только внутренние взаимоотношения между организмами, тогда как на укорененных деревьях положение общего предка показа­но добавочной точкой. Обычно используются два способа графического изображения филогенети­ческих деревьев. Первый способ — это построение радиальных деревьев, напоминающих очертания настоящих, живых деревьев; он удобен при ана­лизе небольшого количества объектов. Филогене­тическая дистанция между двумя узлами (орга­низмами) изображается в виде расстояния между ними (рис. 3, А). Второй способ — это постро­ение дендрограммы, имеющей вильчатую форму; при этом организмы обозначаются на концах вет­вей и ограничений их количества не вводится. Ге­нетическим дистанциям между видами соответ­ствуют только горизонтальные компоненты (дли­на ветвей) (рис. 3, Б).

Рис. 3. Радиальное дерево и дендрограмма, постро­енные на основании 16S-рРНК-анализа. А. Радиальное дерево для пяти организмов. Цифра­ми обозначены значения филогенетических расстоя­ний между видами, соответствующих расстоянию меж­ду точкой ветвления и конечной точкой каждого ребра. Филогенетическое расстояние между двумя организ­мами соответствует сумме разделяющих их сег­ментов (например, расстояние между Vibrio vulnificus и Thermotoga maritima составляет 0,3272, т. е. 0,0104 + 0,0226 + 0,0268 + 0,1710 + 0,0964). Б. Дендрограмма для тех же пяти видов, что в пункте А. Филогенетическим расстояниям соответствует только длина ветвей (горизонтальная компонента).