Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: «III тип гиперчувствительности. Иммунологическая толерантность» – 80 мин

1. Основные механизмы развития иммунокомплексной патологии

2. Понятие иммунологической толерантности

   1. Центральная и периферическая толерантность

   2. Механизмы формирования толерантности

3. Количественное определение антител к тиреоглобулину (Тг) или к тиреопероксидазе (ТПО) методом ИФА

4. Принцип латекс-теста для определения ревматоидного фактора

5. Иммунные комплексы. Методы определения. Фотомет­рия, нефелометрия. РИД. Типирование ИК

6. Техника постановки обнаружения ЦИК. Техника постановки типирования ЦИК. Контроль качества определения ЦИК

4. Выполнение практической работы – 30 мин

Практическая работа

1. Изучить механизм развития III –типа гиперчувствительности по схеме (зарисовать)

2. Изучить метод определения ЦИК (записать в тетрадь, оформить протокол)

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяют ме­тод преципитации. Образование иммунных комплексов (ИК) сопровождает лю­бой иммунный ответ. При нормальном состоянии иммунной системы образовавшиеся комплексы «АГ+АТ» фагоцитиру­ются и удаляются из организма. При патологических состоя­ниях (недостаточность фагоцитоза и др.) ИК, состоящие из аутоантител, аутоантигенов, компонентов комплемента и др. могут откладываться в тканях, на стенках сосудов и т.д., вы­зывая синдром иммунокомплексной патологии. ИК способны активизировать систему комплемента с последующим разви­тием агрессивных реакций. В связи с этим обнаружение ЦИК и определение его состава имеет важное клиническое значе­ние. Существует несколько методов определения ЦИК: пре­ципитация, турбодиметрия, термистография, ИФА и др.

Ме­тод преципитации ЦИК с последующим их типированием наиболее распространен в лабораториях клинической имму­нологии.

Принцип метода. Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен осаждать из сыворотки агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы. Различные концентра­ции ПЭГ (2,5; 3,5%; 7% и 10%) вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплек­сы крупных размеров, высокие концентрации вызывают пре­ципитацию низкомолекулярных соединений. 3,5% ПЭГ преципитирует наиболее распространенные (промежуточные) комплексы средних размеров.

Техника постановки анализа. Анализ ЦИК прово­дится в 2 этапа:

1-й этап – выделение ЦИК,

2-й этап –типирование ЦИК.

1. Выделение ЦИК:

- развести в пробирках сыворотки пациентов боратным буфером из расчета 1:25 или 1:50; 50 мкл сыворотки + 1,2 мл боратного буфера или 100 мкл сыворотки + 2,5 мл боратного буфера;

- добавить в каждую пробирку с сывороткой пациентов 7% раствор ПЭГ а в соотношении 1:1 (1,25 мл или 2,5);

- перемешать стеклянной палочкой, закрыть пробирки пробками. Поставить штатив с пробирками в холодиль­ник +4°С на 18 ч;

- после инкубации центрифугировать 30 мин. при 3000 об/мин.;

- после центрифугирования при наличии осадка (ЦИК) надосадочную жидкость слить, а обнаруженный ЦИК учесть по 4-плюсовой системе.

2. Типирование ЦИК:

- к осадку добавить 1,5 мл 3,5% ПЭГ, перемешать, пере­лить в пробирки типа «эппендорф» и центрифугировать 2 раза по 20 мин. на 8000 об/мин.;

- после первого центрифугирования надосадок слить и до­бавить 1 мл 3,5% ПЭГ;

- после второй промывки слить надосадок, тщательно вытряхнуть жидкость из пробирок типа «эппендорф» на фильтровальную бумагу. Добавить по 0,1 мл ЗФР, пере­мешать. Образцы готовы для внесения их в иммунодиф­фузионные планшеты;

- подготовить иммунодиффузионные планшеты (IgA, IgM, IgG);

- внести в иммунодиффузионные планшеты по 5–10 мкл контрольного образца (титр разведения указан на флако­не и в инструкции);

- внести в лунки планшета по 5–10 мкл образцов исследуе­мых сыво-роток;

- инкубировать при комнатной температуре 24 ч;

- провести измерение колец преципитации контрольного образца и исследуемых проб с помощью бинокулярной лупы на трех планшетах (IgA, IgM, IgG).

Учет результатов:

1. Построить калибровочную кривую зависимости величины диаметра преципитата от кон­центрации ЦИК. По­строить калибровочную кривую на каждую из трех план­шет (IgA, IgM, IgG);

2. Рассчитать значения концентраций компонентов ЦИК исследуемых образцов пациентов по калибровочной кри­вой.

Контроль качества. Контроль качества по карте Шухарта.

У здоровых людей ЦИК в РИД – отрицательный.

4. Изучить метод определения ревматоидного фактора (записать в тетрадь, оформить протокол, табл.18).

Метод определения ревматоидного фактора

Принцип метода. Основан на реакции агглютинации между ревматоидным фактором (РФ) образца пациента или контрольной сывороткой и человеческим IgG, находящимся на полистироловых латексных частицах. IgG + AT к IgG —► агглютинация.

Исследование латекс-теста позволяет сделать полуколичест­венное определение ряда иммунопатологических показате­лей (например ревматоидного фактора (РФ) и др.) в неразбавленной сыворотке методом агглютинации латексных частиц. Метод удобен в исполне­нии, экономически выгоден, время анализа – 2–3 мин. В на­боре имеются положительный и отрицательный контроли. Определение ревматоидного фактора играет важную роль в диагностике ревматоидного артрита, при котором наблюда­ются значительные нарушения иммунной системы. Они обу­словлены неполноценным иммунным ответом с образовани­ем иммунных комплексов. В формировании последних ос­новную роль играет РФ, который представляет собой в ос­новном AT IgM, направленный против IgG.

Техника постановки анализа: перед постановкой реакции сыворотку пациента и набор выдержать в течение 30 мин. при комнатной температуре.

Пипетировать на слайд-стекло в отдельные лунки:

- сыворотку пациентов – 40 мкл;

- положительный контроль – 40 мкл;

- отрицательный контроль – 40 мкл;

- добавить в каждую лунку по 40 мкл латексного реагента;

- осторожно перемешать содержимое лунок стеклянной па­лочкой;

- результаты учесть через 2–3 мин.

Учет результатов:

- анализ образцов пациентов проводить после получения результатов отрицательного и положительного контро­лей;

- отсутствие агглютинации в сыворотке указывает на от­сутствие РФ;

- при положительной реакции (четкая агглютинация) сле­дует провести титрование сыворогок буферным раство­ром в различных соотношениях: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 и т.д. (табл.20);

- отрицательным будет результат, содержащий в образце РФ менее 20 МЕ/мл;

- положительный резулат (четкая агглютинация) указы­вает на количественное содержание РФ в сыворотке па­циента.

Таблица 18

Титр разведения (сыворотка + буферный р - р)	РФ в МЕ/мл (условно)
1+1 (1:1)	24
1+3 (1:4)	48
1+7 (1:8)	96
1+15 (1:16)	192
1+31 (1:32)	384
	и т.д

Примечание: 1+1 —> 40 мкл сыворотки + 40 мкл буферного раствора

Контроль качества:

- отрицательный контроль – отсутствие агглютинации в лунке;

- положительный контроль – четкая агглютинация в лунке слайд-стекла.

Стандартизация метода:

- использование чистых слайд-стекол для проведения латекс-реакции;

- использование чистых стеклянных палочек для смешива­ния реагентов;

- использование точных дозированных пипеток;

- строгое соблюдение времени проведения реакции, ука­занного в инструкции;

- использование правильного освещения для учета резуль­татов агглютинации;

- правильное разведение используемых реагентов;

- обязательное использование отрицательных и положи­тельных контролей при постановке реакции;

- строгое соблюдение условий хранения реагентов.

Преимущество метода:

- скрининг-тест;

- возможность широкого использования.

Недостаток метода: визуальная оценка результа­тов

5. Изучить метод количественного определения антител к тиреоглобулину (Тг) или к тиреопероксидазе (ТПО) ИФА (записать в тетрадь, оформить протокол)

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы характери­зуются присутствием в сыворотке крови антител к одному или более тиреоидным антигенам. Присутствие аутоантител к тиреоглобулину важно для этиологии острых и подострых нарушений функции щитовидной железы. Нормальное со­держание антител у здорового человека – менее 100 МЕ/мл.

Используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Лунки планшетов покрыты тиреоглобулином. При внесении в лунки образцов пациентов происходит образование комплекса «АТ+АГ». Антиген, сорбированный на плашке, связывается с содержащимися в образцах пациен­тов антителами. Комплекс «АГ+АТ» выявляется конъюгатом мышиных моноклональных антител с пероксидазой к имму­ноглобулину G человека.

Техника постановки анализа:

- перед исследованием набор и образцы выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин.;

- образцы вносить в дубле;

- внести в первые 12 лунок по 100 мкл 6 калибраторов в дублях;

- внести в лунки для образцов по 90 мкл раствора для раз­ведения образцов и по 10 мкл анализируемых сывороток;

- инкубировать планшет 60 мин. при t = 37°С;

- промыть лунки не менее 4 раз промывочным раствором, просушить на фильтровальной бумаге;

- быстро внести в лунки по 100 мкл раствора конъюгата;

- инкубировать 30 мин. при t = 37°С;

- промыть планшет не менее 4 раз;

- быстро внести в лунки по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси;

- инкубировать 10 мин. при комнатной температуре без пе­ремешивания;

- внести в лунки по 100 мкл 10% H₂S0₄ (для остановки реакции);

- инкубировать 20–30 с на динамическом шейкере при ком­натной температуре.

Учет результатов. На спектрофотометре измеряется оптическая плотность при 492 нм. При использовании про­граммы измерения на спектрофотометре можно получить ко­личественное содержание антител к тиреоглобулину. При отсутствии возможности получения количественного содер­жания антител строится калибровочная кривая и по ней оп­ределяется содержание AT в исследуемых образцах.

Контроль качества. На карте Шухарта откладыва­ются значения контрольной сыворотки при каждой поста­новке анализа.

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Практическое занятие 14

Тема. Иммунопатология. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). IV-тип по классификации Кумбса. Иммунный пролиферативный ответ. Оценка гиперчувствительности замедленного типа внутрикожными пробами и РТМЛ. Специфическая профилактика при бактериальных и вирусных инфекциях. Современная классификация вакцин. Требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам. Вакцины: живые, убитые, химические, анатоксины. Вакцины нового поколения. Иммунная биотехнология. Принципы получения иммунных и диагностических препаратов in vivo и in vitro. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Реакция флоккуляции

Цель занятия. Изучить механизм развития ГЗТ. Ознакомить студентов с иммунобиологическими препаратами, применяемыми для лечения и профилактики инфекционных заболеваний