Занятие 2 («Хроматографическое разделение аминокислот. Высаливание белков. Количественное определение белков»)

Цель занятия: 1) ознакомиться с физико-химическими свойствами белков (мо­­лекулярная масса, растворимость, электролитические свойства, денатурация, амфотерность), с видами связи аминокислот в белковой молекуле, со строением полипептидной цепи, её пространственной структурой и химическими связями, поддерживающими пространственную конфигурацию, с клас­си­фикацией белков, с важнейшими представителями простых белков; 2) выполнить лабораторную работу по осаждению белков высаливанием, определить количество белка в исследуемой жидкости; 3) познакомиться с простейшим приёмом хроматографического разделения аминокислот.

Студент должен знать следующее:

1. Почему для определения молекулярной массы /ММ/ белков неприемлемы эбулиоскопический и криоскопический методы.

2. Принципы осмометрического и диффузионного методов, принцип метода ультрацентрифугирования.

3. Принцип и технические приёмы гель-фильтрации.

4. Чем обусловлена растворимость белка в воде, какие факторы или воздействия её изменяют, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.

5. Понятия «нативный» и «денатурированный» белок, виды денатурирующих воздействий; изменения, происходящие при денатурации, а также разницу между коагуляцией (осаждением) и денатурацией.

6. От чего зависит заряд белковой молекулы, значение понятий «изоэлектрическая точка» и «изоэлектрическое состояние».

7. Принцип разделения аминокислот хроматографическими методами.

8. Принципы классификации соединений белковой природы в зависимости от состава (наличие или отсутствия компонентов, не являющихся аминокислотами).

9. Классификацию простых белков (протеинов), в частности, простых белков животного организма

Студент должен уметь:

1. Различать по данным о качественном составе белковой молекулы простые и сложные белки.

2. Различать на основании данных об аминокислотном составе и о молекулярной массе /ММ/ протеины и полипептиды.

3. Рассчитать ММ простого белка по его аминокислотному составу.

4. Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») про­гнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.

Студент должен получить представление:

1. О принципах определения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации и ультрацентрифугирования,

2. Об использовании в медицинской практике свойства белков осаж­даться тяжелыми металлами,

3. О том, как используют данные об электрофоретической подвижности белков в диагностических целях,

4. О значении данных об аминокислотном составе пищевых белков как критерия полноценности рационов питания.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1) расчет ММ по структурной формуле соединения,

2) сведения о «гидратной» воде,

3) сведения об осмотическом давлении, его связи с ионным составом и концентрацией ионов,

4) сведения о реакциях гидролиза,

5) понятие о началах термодинамики,

6) сведения о принципе и технике колориметрии и нефелометрии.

Аудиторная работа Лабораторная работа (Хроматографическое разделение аминокислот - демонстрация прибора и хроматограммы. Высаливание белков, их количественное определение)

1. Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония может использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины - при 100%-ном насыщении.

Ход работы. В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать - на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.

Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду - происходит растворение осадка.

2. Количественное определение белка в моче основано на реакции осаждения белка сульфосалициловой кислотой и определении мутности осадка (нефелометрическое определение).