22 Гомогенные биокаталитические системы.

Присутствие в среде органического растворителя существенно влияет на процесс образования фермент-субстратного комплекса за счет изменения растворимости субстрата и его распределения в системе. В водно-органических смесях гидрофильные субстраты концентрируются у поверхности фермента, а гидрофобные в основном локализуются в объеме растворителя. Кроме того, органические растворители могут влиять на эффективность непосредственного контакта субстрата с ферментом. При этом решающую роль будет играть характер связывания участников биокаталитической реакции. При переходе от водных растворов к водно- органическим смесям Km в случае гидрофобного взаимодействия обычно возрастает, а при электростатическом уменьшается. При добавлении растворителя в умеренных количествах в большинстве случаев образуются истинные растворы ферментов, т. е. гомогенные биокаталитические системы. В случае полярных растворителей для многих ферментов каталитическая активность сохраняется на “водном уровне” вплоть до некоторого критического значения концентрации растворителя. При дальнейшем повышении концентрации ферменты полностью или практически полностью теряют каталитическую активность. В настоящее время выделяют две причины, приводящие к потере активности ферментов в водно-органических смесях: обратимую денатурацию и необратимую инактивацию биокатализатора. В основе механизма денатурации ферментов органическими растворителями лежит разрушение системы водородных связей, а также нативных гидрофобных взаимодействий, в результате чего гидрофобные остатки из внутренней области “выходят” на поверхность белка. Обогащение поверхности гидрофобными и полярными группами, ранее располагавшимися во внутренней области, приводит к агрегации молекул денатурированного белка. В системе с органическими растворителями агрегация реализуется через межмолекулярные взаимодействия электростатической природы (ионные пары, водородные связи). Теоретически возможно образование белковых агрегатов из каталитически активных молекул, в частности при значениях рН, близких к изоэлектрической точке фермента. Однако, как правило, количества полярных групп на поверхности белка в нативной конформации недостаточно для агрегации фермента в водно-органической смеси. Поэтому в большинстве случаев для эффективного протекания процесса агрегации белок должен вначале подвергнуться денатурации. Добавки органических растворителей, смешивающихся с водой, позволяют решить проблему растворимости субстратов. Помимо этого, увеличение содержания в водно-органических смесях неводного компонента, как правило, приводит к некоторому сдвигу равновесия обратимых реакций гидролиза-синтеза в сторону синтеза. В первую очередь это обусловлено изменением константы диссоциации ионногенных групп компонентов реакции. В частности, повышение содержания органического растворителя в смеси сопровождается увеличением константы диссоциации кислот. В результате такого изменения равновесие сдвигается в сторону образования производного кислоты. Например, в реакции прямого ферментативного синтеза пептидов при переходе от водного раствора к смеси, содержащей 85 % 1,4-бутандиола, константа равновесия возрастает в 80 раз. Однако при высоких концентрациях органических растворителей активность и стабильность большинства ферментов могут существенно снижаться. Тем не менее известны примеры, когда, несмотря на это удается добиться проведения ферментативного синтеза пептидов с высокой скоростью и 97%-ным выходом.