2. Неконкурентное ингибирование

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра (рис. 2-24). Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Кинетические зависимости

Кинетическая зависимость неконкурентного ингибирования представлена на рис. 2-25. Этот тип ингибирования характеризуется снижением V_max ферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т.е. увеличением К_m.

Б. Необратимое ингибирование

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg²⁺), серебра (Ag⁺) и мышьяка (As³⁺), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению (рис. 2-26). При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

1. Специфические и неспецифические ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения

Рис. 2-23. Схема активного центра ацетилхолинэстеразы. А - присоединение ацетилхолина в активном центре фермента. Стрелкой указано место гидролиза эфирной связи в молекуле ацетилхолина; Б - присоединение конкурентного ингибитора - прозерина в активном центре фермента. Указано место гидролиза прозерина, однако реакция идёт намного медленнее, чем с ацетилхолином; В - присоединение конкурентного ингибитора в активном центре фермента - эндрофония. Эндрофоний связывается в активном центре ацетилхолинэстеразы, препятствуя присоединению ацетилхолина.

механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными

105

Рис. 2-24. Схема неконкурентного ингибирования активности фермента.

химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента.

Роль гидроксильных групп серина в механизме катализа исследуют с помощью фторфосфатов, например диизопропилфторфосфата. Дии-зопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение (табл. 2-2). Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибиторам "сериновых" ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа (рис. 2-27).

Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков (рис. 2-28). Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они

106

Рис. 2-25. Влияние неконкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата. V_max - максимальная скорость реакции в отсутствие ингибитора; 'V_max - максимальная скорость реакции в присутствии ингибитора; К_m - константа Михаэлиса в отсутствие ингибитора; 'К_m - константа Михаэлиса в присутствии ингибитора.

Рис. 2-26. Механизм действия ионов ртути как необратимого ингибитора. Ионы ртути в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Рис. 2-27. Ингибирование активности химотрипсина с помощью диизопропилфторфосфата.