биофизика мембран укр

61

урівнюються діючими у протилежному напрямі силами гідратаційного та електричного відштовхування.

Рис. 8.2. Конструкція вимірювального пристрою з трьох камер (І, ІІ, ІІІ) для дослідження злиття БЛМ: 1, 2, 3 – електроди, 4, 5 – стрижні [6].

Виявляється, що стан 2 є метастабільним, тобто через деякий час відбувається самодовільний перехід з 2 в 3. В рамках цієї стадії два бішари, що знаходяться у щільному контакті, перетворюються в один бішар, тобто відбувається напівзлиття: мембрани об'єднались, але водні об’єми камер І і III роз'єднані. Злилися лише зовнішні моношари мембран. Щоб у цьому переконатися, достатньо помітити ліпіди у зовнішньому моношарі однієї мембрани, наприклад, включити до неї певну кількість заряджених ліпідів, тоді як інша мембрана таких не містить. Вимірювання поверхневого потенціалу показали, що після завершення напівзлиття заряджені ліпіди знаходяться у зовнішньому моношарі іншої мембрани. Стан 3 (рис. 8.3) є доволі стійким. Зруйнувати контактний бішар і тим самим завершити процес злиття (рис. 8.3, стан 4) можна, якщо прикласти до контактного бішару електричне поле. В результаті зростає ймовірність появи у ньому пори, динамічний розвиток якої призводить до порушення бішару. Ця стадія фактично завершує процес злиття, оскільки тепер об'єднані і мембрани, і водні об’єми відсіків І та III.

Механізм напівзлиття. Можна уявити декілька механізмів перетворення двох бішарів в один. Наприклад, нехай ліпідні молекули одного бішару розсуваються і між ними розміщуються ліпіди з іншого бішару. Енергетичні розрахунки, однак, показують, що для реалізації цього механізму інтеркаляції необхідно прикласти до вихідних бішарів досить високий тиск, який еквівалентний створюваному водяним стовпом у 100 км висотою. Це пов'язано із затратами зусилля на те, щоб перенести полярні голівки фосфоліпідів через гідробофний шар мембрани. Цей факт був доведений прямими експериментами. Вихідні бішари формували з різних фосфоліпідів (один з нейтральних, інший – із заряджених). Потім їх з'єднували, отримували контактний бішар і вимірювали густину поверхневого заряду на його моношарах. Очевидно, якщо працює механізм вбудовування, тоді обидва моношари контактної мембрани мають бути однаково зарядженими з половиною від вихідної густини зарядів. Результат виявився інший: один моношар залишився нейтральним, а інший – зберіг попередній заряд. Висновок:

62

контактний бішар формується з віддалених моношарів вихідних мембран, а розміщені поблизу моношари відступають від ділянки контакту.

Візуальні спостереження вказують, що напівзлиття бішарів починається з однієї точки. Це також підтверджують вимірюваннями ємностей даної системи. У стані плоско-паралельного контакту ємність незначна, оскільки вона визначається двома послідовно включеними конденсаторами, кожний з яких еквівалентний одному бішару. Деякий час ємність залишається сталою, після чого починає зростати і досягає значення, яке дорівнює ємності бішару. Дослідження показали, що час очікування напівзлиття має порядок від секунди до хвилин і суттєво залежить від ліпідного складу мембрани. Зростання ємності з часом, ймовірно, відображує динаміку росту зародку контактного бішару. Далі розглянемо структуру цього зародку, як він виникає і розвивається.

Модель сталків. Модель у загальному випадку схематично зображено на рис. 8.3, детальніше – на рис. 8.4. Перше за все відзначимо, що напівзлиття є енергетично вигідним, оскільки перехід зі стану 2 в 3 зменшує сумарну поверхню системи: замість двох бішарів отримуємо один. Однак стани 2 і 3 відокремлені активаційним бар'єром, який визначає час очікування моношарового злиття. Побороти цей бар'єр допомагають теплові флуктуації. Висота бар'єру багато в чому визначається властивостями проміжних станів, через які відбувається перехід 2→3. Їх вибір визначається тим, які деформації відбуваються з бішаром під час теплових флуктуацій.

Рис. 8.3. Модель утворення сталка – послідовність проміжних станів при злитті двох ліпідних бішарів [6].

Нагадаємо, що ліпідний бішар – РК. Латеральна рухливість ліпідних молекул значна і в цьому напрямку мембрана поводить себе як рідина. В перпендикулярному до поверхні напрямку ліпідний бішар ближчий за властивостями до твердого тіла, він важко піддається стисканню. Крім того, ліпідному бішару властива жорсткість на вигин. Щоб його зігнути, необхідно прикласти вигинаючий момент сил. Саме ці види деформації – латеральне зміщення молекул та їх вигин, які активуються тепловою енергією середовища,

– важливі для виникнення зародку напівзлиття і його подальшого росту.

На рис. 8.4 зображена послідовність станів на шляху від двох бішарів до одного контактного бішару. Вважається, що під дією теплових флуктуацій відбуваються локальні деформації вигину та латерального зсуву, внаслідок чого утворюються дефекти, за яких у розчин експонуються гідрофобні хвости ліпідних молекул.

63

Рис. 8.4. Один з можливих механізмів злиття фосфоліпідних мембран: А – плоскопаралельний контакт; Б – утворення перемички між локальними спучуваннями близько розміщених моношарів; В – триламінарна структура; Г – утворення наскрізної пори у бішаровій перетинці; Д – утворення трубки (повне злиття) [3].

Притягування цих гідрофобних ділянок на сусідніх мембранах призводить до формування між ними перемички, яку назвали сталком. Сталк характеризується високою енергією, оскільки бішар, який його формує, істотно вигнутий. Розширення сталка, яке супроводжується злиттям віддалених моношарів, призводить до утворення контактного бішару. Однак, для того щоб сталк спонтанно розширювався, його енергія повинна зменшуватись з розширенням. Розрахунок енергії сталка показав, що вона залежить від природи ліпідів та їх здатності до деформацій вигину.

Молекулярна геометрія ліпідів. У мембранології поширене поняття «молекулярна форма ліпіду», яке відображує співвідношення розмірів полярної голівки і гідрофобної частини молекули. Під формою ліпідних молекул розуміють не просто конформацію окремої молекули, а ефективну форму ліпідів у побудованому з них моношарі, яка відображає взаємодію молекул між собою та з оточуючим розчином (рис. 8.5).

Рис. 8.5. Форма ліпідних молекул (А) та структура мембрани (Б) [6].

Так, молекула лізоліпіда, у якої голівка ширша хвоста, – це конус, фосфатидилхолін – циліндр, фосфатидилетаноламін, у якого голівка вужча хвоста, – обернений конус. При переході від окремих молекул до опису моношару в цілому прийнято характеризувати його так званою спонтанною кривизною. Вона визначається як кривизна, якої набув би вільний моношар. Спонтанна кривизна моношару відрізняється від реальної геометричної

64

кривизни, яка обумовлена не формою молекул, які до нього входять, а сукупністю діючих на нього зовнішніх сил і моментів. Так, моношар, який містить лізоліпід, прагне стати вигнутим, а моношар, який містить фосфатидилетаноламін, ввігнутим. Прийнято вважати, що у першому випадку моношар характеризується позитивною спонтанною кривизною, а в іншому – негативною. Наприклад, молекули-конуси сприяють виникненню пор (рис. 8.5, А, І), а обернені конуси – виникненню сталків (рис. 8.5, А, ІІІ). Отже, введення у моношари лізоліпідів гальмує злиття, а введення фосфатидилетаноламінів – сприяє цьому. Включення лізоліпідів у віддалені моношари сприяє руйнуванню контактного бішару. Розроблена теорія сталків підтверджена експериментально, зокрема, було встановлено, що за достатньо високої негативної спонтанної кривизни ріст сталка енергетично вигідний.

Дослідження злиття у модельних системах дозволили отримати деякі принципово важливі результати. Перш за все вдалося показати, що ліпідні бішари за щільного контакту можуть самодовільно зливатися. Крім того, встановлено, що процес перезамикання мембран відбувається через дві послідовні стадії. Під час першої виникає місток (сталк) між розташованими близько моношарами, який розширяється, формуючи контактний бішар. Цьому процесу сприяє негативна спонтанна кривизна моношарів. Наступна стадія – перехід від напівзлиття до повного злиття – потребує руйнування контактного бішару, чому сприяє позитивна спонтанна кривизна віддалених моношарів або підвищений натяг. Цей результат, отриманий у модельних системах, має загальний характер, тобто він працює і при розгляді механізмів злиття реальних біологічних мембран.

Злиття біологічних мембран – це багатостадійний процес, у якому беруть участь білки і ліпіди. Роль білків полягає у тому, що вони приводять до щільного локального контакту мембрани-учасника злиття. Залишається до кінця нез'ясованим, які саме білки і як вони виконують цю складну функцію. За допомогою модельних систем вдалося встановити, за яких умов ліпідні шари можуть самодовільно зливатися. Якщо на ділянці локального контакту біомембран відбувається напівзлиття, виникає питання, яким чином руйнується контактний бішар. Найбільш прийнята гіпотеза зводиться до того, що білки злиття створюють додатковий натяг або вигинаючий момент, розрив якого призводить до утворення пори злиття.

У літературі [1] розглядаються моделі злиття ліпідних мембран на основі низькоенергетичних проміжних станів, розраховується енергія стисненої пори, враховується вплив спонтанної кривизни. Як було розглянуто вище, початкова стадія злиття – вигин мембран назустріч одна одній з утворенням так званих димплів. Енергію, необхідну для такої деформації, ймовірно, забезпечують білки злиття, як, наприклад, гемагглютинін у випадку віруса грипу. Сили гідратаційного відштовхування прагнуть видалити гідрофільні голівки ліпідних молекул з межі контакту димплів. У результаті на вершинах димплів утворюються гідрофобні ділянки, притягання яких призводить до злиття цисмоношарів і утворення сталку. Для об’єднання транс-моношарів необхідно розширення сталку. Передбачається, що на цій стадії ліпідні молекули транс-

65

моношару зміщуються перпендикулярно його поверхні, формуючи таким чином модифікований сталк. Модель процесу злиття зручно розглядати у зворотному напрямку, тобто від пори злиття до модифікованого сталка. Коли розмір водного просвічування пори досягне 4-6 Å, рух транс-моношару припиняється внаслідок дії сил гідратаційного відштовхування. Подальше зменшення радіуса можливе лише за рахунок стискання бішару, що формує пору. При зменшенні перерізу стиснутої пори її енергія зростає і за деякого радіусу стає рівною енергії модифікованого сталка. У цій точці за таких умов термодинамічно можливий перехід модифікованого сталка у стиснуту пору. Був проведений розрахунок енергії стисненої пори з урахуванням деформацій вигину та розтягу/стискання. Припускалося, що поверхні моношарів – тороїдальні, спряжені зі сферичними сегментами димплів. Така конфігурація системи дозволяє знайти кутовий розподіл товщини бішару за кожного фіксованого радіусу стиснутої пори. Для знаходження положення межі розділу моношарів проводили мінімізацію енергії вигину і розтягу/стискання кожного елементарного об’єму бішара. За відомою товщиною бішара та положенням межі визначали кутовий розподіл товщини кожного моношара. Отримані товщини використовували для обчислення сумарної енергії системи. Енергію вигину системи обчислювали за припущення ненульової спонтанної кривизни транс-моношару. У цьому випадку основні положення даної моделі [1] допускають експериментальну перевірку у дослідах з вимірювання очікуваного часу злиття за модифікації транс-моношару ліпідами різної молекулярної геометрії. Отримано, що за радіусу 37 Å енергія стиснутої пори дорівнює енергії модифікованого сталка такого ж радіуса. Проведені числові розрахунки показують, що енергетичний бар’єр переходу модифікованого сталка у стиснуту пору може бути подоланий за рахунок теплових флуктуацій. Процес злиття завершується об’єднанням ліпідних бішарів та водних об’ємів клітин.

Рекомендована література:

1.Акимов А.С., Чизмаджев Ю.А., Кузьмин П.И. Модель слияния липидных мембран, основанная на низкоэнергетических промежуточных состояниях. Расчет энергии сжатой поры. Учет влияния спонтанной кривизны. [Електронний ресурс] // Режим доступу: http://mipt.ru/nauka/conf_mipt/conf2001/fmbf/biotech/akimov.html. – XLIV

научная конференция МФТИ. – 2001.

2.Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 с. (глава 9, §9.5 Слияние мембран, §9.7 Передача сигналов в животных клетках, стр. 424-454).

3.Рубин А.Б. Биофизика: учеб. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 2004. – Т.2 (Биофизика клеточных процессов). – 470 с. (глава ХVІ. Конформационные свойства мембран, §5. Влияние электрических полей на клетки, стр. 36-46).

4.Рыбальченко В.К., Коганов М.М. Структура и функции мембран: Практикум. – К.: Вища школа, 1988. – 312 с. (глава ІІ. Обзор основных методов и методических подходов, используемых в исследовании мембранных структур, §2.5. Слияние и реконструкция мембран, стр. 138-145; глава ІІІ. Практические работы, §3.21. Исследование слияния, стр. 288-292).

5.Уилсон Дж., Хант Т. Молекулярная биология клетки: Сборник задач. – М.: Мир, 1994. – 520 с. (глава 6, стр. 46-70).

66

6.Чизмаджев Ю.А. Как сливаются биологические мембраны // Сорос. образов. журн.

– 2001. – Т.7, №5. – С. 4-9.

7.The structure of biological membranes / 2nd ed., Yeagle P.L., ed. – CRC Press, Boca Raton–London–New York–Singapore, 2005 – 840 р. (главы 8-11 та 16).

8.Bioelectrochemistry of membranes / Walz D., Teissie J., Milazzo G., eds. – Birkhauser, Basel–Boston–Berlin, 2004. – 240 p. (главы 5-6).

Контрольні запитання для засвоєння матеріалу:

1.Які існують біофізичні методи для дослідження злиття мембран?

2.Охарактеризуйте сучасні механізми напівзлиття мембрани.

3.Які функції біомембрани пов’язані з можливим злиттям мембран?

Тема на самостійний розгляд:

«Руйнування мембранних структур (механізм руйнування ліпідного бішару). Реконструкція біомембран».

Тема №9. «Особливості міжмолекулярних взаємодій у біомембранах»

За реальних умов не лише природні, але й часто штучні мембрани неоднорідні за ліпідним та білковим складом. У структурній організації стабілізації таких систем поряд з гідрофобними ефектами важливе місце займають такі взаємодії:

1. ліпід-ліпідні; 2. ліпід-білкові; 3. білок-білкові.

Вони характеризують явища, які призводять до нерівномірного розподілу молекулярних компонентів у мембранах – мікрогетерогенності мембран.

1. Ліпід-ліпідні взаємодії. Це специфічні взаємодії, які виникають у мембранних системах внаслідок неоднорідності ліпідного складу. Серед різних чинників, що визначають стан ліпідів у мембранах, найвагоміше значення мають електростатичні сили притягання та відштовхування між зарядженими полярними голівками, стеричні фактори, що враховують форму молекул ліпідів та характер розміщення їх голівок і гідрофобних вуглеводневих хвостів, «сили гідратації», а також водневі зв’язки між голівками ліпідів. Гідратаційні сили відіграють важливу роль при взаємодії фосфоліпідних мембран між собою. Шар води 10-30 Å навколо зовнішньої полярної поверхні перешкоджає зближенню мембран та їх безпосередньому контакту. Для видалення такого шару необхідно порушити його конформаційний стан і затратити енергію, що, власне, і лежить в основі прояву гідратаційних сил.

Гідратація ліпідів залежить від їх природи. Як правило, менша гідратація має місце у ліпідів з донорними і акцепторними групами, що беруть участь в утворенні водневих зв’язків. Їхня гідратація обумовлена участю груп полярних голівок ліпідів в утворенні водневих зв’язків між собою. Для цього необхідно зруйнувати водневі зв’язки з водою ліпідних груп та утворити свій водневий

зв’язок: А – Н … ОН2 + В … НОН → А –Н … В + НОН …ОН2, де А – воденьдонорна, а В – водень-акцепторна група двох ліпідних молекул.

Очевидно, що ця реакція буде відбуватися лише тоді, коли при цьому сумарна стабільність утворених водневих зв’язків у правій частині рівняння буде більшою, ніж у водневих зв’язків з водою груп А–Н і В. Вивільнення

67

молекул води з поверхні бішару, яке супроводжує цей процес, буде викликати збільшення ентропії системи, що дає внесок у компенсацію енергетичних затрат для розриву водневих зв’язків між ліпідами і водою. Ці водневі зв’язки легко розриваються та утворюються за час 10-11-10-12 с знову між іншими ліпідами. Єдина система лабільних водневих зв’язків сприяє прояву кооперативних властивостей.

Енергію взаємодії системи, яка складається з двох ліпідних компонентів А і В, можна представити у вигляді парних потенціалів ФАА, ФВВ, ФАВ. Якщо різниця ФАВ – ½(ФАА+ФВВ) незначна, тоді у системі має місце рівномірний розподіл компонентів А і В. Коли ж потенціали взаємодії значно відрізняються, стає можливим компенсувати зменшення ентропії внаслідок зростання впорядкованості системи. У цьому випадку слід очікувати нерівномірного розподілу ліпідів і розшаровування системи. Оскільки основний внесок в енергію взаємодії ліпідів у мембранах обумовлений дисперсійною взаємодією вуглеводневих ланцюгів, ці ефекти найбільш виражено проявляються у мембранах, сформованих з ліпідів, які відрізняються довжиною вуглеводневих ланцюгів. У природних мембранах, які містять різні компоненти, ймовірний гетерогенний розподіл ліпідів. Накопичено значний експериментальний матеріал, який підтверджує цю можливість, однак функціональне значення гетерогенного розподілу ліпідів у мембранах залишається дискусійним питанням.

Таким чином, ліпід-ліпідні взаємодії будуть залежати від: 1) енергії електростатичних сил; 2) стеричного фактора локалізації у мембрані фосфоліпідних голівок та хвостиків; 3) енергії гідратації та утворення водневих зв’язків; 4) утворення фосфоліпідних доменів.

2. Ліпід-білкові взаємодії. В основі таких взаємодій лежать міжмолекулярні дисперсійні та електростатичні сили, водневі зв’язки або інші ефекти зв’язування.

Ліпід-білкові взаємодії та обумовлені ними явища умовно класифікують так: І. взаємодії білок – ліпідний моношар;

ІІ. взаємодії білок – ліпідний бішар;

ІІІ. ліпід-білкові взаємодії у мембранах, які включають ліпід-залежні ферменти.

І. Взаємодія білків з ліпідними моношарами вивчається при включенні в моношари радіоактивно мічених білків (альбумін, цитохром С). Електростатичні взаємодії між білками і моношаром проявляються у вигляді сорбції білків на заряджених моношарах при відхиленні від ізоелектричної точки білків. У дослідах з фосфоліпідами показано, що електростатичні взаємодії визначають початкові етапи взаємодії фермент-ліпідний моношар, які суттєво полегшують наступну стехіометричну орієнтацію компонентів фермент-субстратного комплексу.

ІІ. Взаємодія білок-ліпідний бішар – високоспецифічний та багатостадійний процес, який характеризується поряд з поверхневою сорбцією внутрішньомембранним вбудовуванням білків. Експериментальним критерієм вбудовування білків у ліпідний бішар, як правило, слугує зміна іонної

68

проникності мембран. У модельних експериментах вбудовування мембранних білків у штучні бішарові системи відіграє визначальну роль при їх функціональній реконструкції.

ІІІ. Ліпід-білкова взаємодія у мембранах проявляється при утворенні всередині мембран специфічного ліпідного оточення навколо білкових молекул. Такі ліпіди називаються зв’язаними або аннулярними. За допомогою методу ЕПР підтверджені зміни рухливості та характеру упаковки вуглеводневих ланцюгів під впливом білків. Методами ЕПР, ЯМР і флуоресценції показано, що пертурбуюча дія різних інтегральних та периферичних білків (цитохром С, мієлін, родопсин, білки тилакоїдних мембран тощо) поширюється до четвертого шару ліпідів, які оточують молекулу білка.

Функціональне значення аннулярних білків, як правило, пояснюють, базуючись на експериментальних даних, згідно з якими сильніша активність білків проявляється у менш в’язкому ліпідному оточенні. Це показано, наприклад, для цитохром-С-оксидази, вбудованої у штучні ліпідні мембрани різного складу, або у випадку АТФаз у мембранах ауксотрофних мікроорганізмів.

На сьогодні описано кілька десятків мембранних ферментів, активність яких залежить від присутності ліпідів. Деякі з них, наприклад, мітохондріальні електрон-транспортні білки, незначно чутливі до ліпідного складу, але ефективно активуються сумарною ліпідною фракцією, яка містить певну кількість ненасичених ліпідів. Для досягнення максимальної активності інших ферментів необхідні ліпіди визначеного складу. Ці ферменти проявляють специфічність щодо полярних голівок ліпідів і слабко залежать від жирнокислотного складу. На противагу цьому, функціональна активність, наприклад, родопсину залежить від довжини вуглеводневих ланцюгів ліпідів.

Ліпідна залежність активності мембранних ферментів може проявлятись за умов селективної екстракції мембранних ліпідів та при наступному додаванні певних ліпідів до деліпідизованих мембран. Так, наприклад, м’яка ефірбутанольна екстракція плазматичних мембран печінки призводить до зниження базальної аденілатциклазної активності та гормон-стимульованих відповідей. Базальну активність відновлюють при додаванні до мембран фосфатидилінозитолу. Майже повне відновлення гормон-стимульованої активності спостерігають при додаванні до мембран фосфатидилсерину. Можливо, що взаємодія аденілатциклази з певними ліпідами мембран необхідна для прояву активності каталітичного центру і утворення активного гормон-рецепторного комплексу.

Отже, у РК-фазі ліпіди можуть виконувати ще одну важливу функцію, крім багатьох інших. Ця функція полягає у регуляції активності майже всіх мембранно-зв’язаних ферментів. Вона, як припускають, відбувається таким чином:

1) геометрія молекули фермента змінюється за рахунок гідрофобних взаємодій так, що активний центр фермента стає доступним субстрату,

69

внаслідок чого переходи ліпідів з однієї мезоморфної фази в іншу суттєво змінюють активність мембранних ферментів;

2) ймовірно, ліпіди сприяють утворенню мультимолекулярних ферментативних комплексів, що забезпечує просторово-часову організацію біохімічних і фізико-хімічних процесів у клітині. Повна регуляція активності мембранних білків-ферментів ліпідами не може відбуватися лише за рахунок гідрофобних білок-ліпідних взаємодій (між ацильними залишками молекули ліпіда і неполярними групами білкової молекули). Можливі ще прояви іонних взаємодій, водневих зв’язків, зв’язків з утворенням містків через двовалентні катіони та ін.

Отже, ліпід-білкові взаємодії визначаються:

1)сорбцією та електростатичними взаємодіями білка і ліпідів на поверхні моношару;

2)внутрішньомембранним вбудовуванням та взаємодією білка і ліпіда (анулярний шар) в біліпідній мембрані.

3. Білок-білкові взаємодії. Ці взаємодії проявляються у мембранах у вигляді зворотної внутрішньомембранної агрегації мембранних білків, що часто супроводжується зміною функціональної і ферментативної активності системи. Так, у мембранах еритроцитів рівномірно розподілені білкові внутрішньомембранні частинки, які зворотно агрегують при значеннях рН нижче 5,5. Агрегація чутлива до складу водної фази: із зростанням концентрації електролітів і за низьких значеннях рН агрегація призупиняється. Ця внутрішньомембранна агрегація білкових частинок в еритроцитах корелює зі зміною розподілу поверхневих рецепторів. Виявлено, що цикли агрегації- дезагрегації білків у клітинних мембранах – широко розповсюджене явище, яке проявляється при піноцитозі, на деяких стадіях клітинного циклу, при взаємодії і злитті мембран та ін. Припускають, що в основі агрегаційних взаємодій можуть лежати сили електростатичного характеру або більш складні взаємодії, опосередковані особливостями ліпідного оточення білків, а також локальна кристалізація ліпідів у мембранах. Таким чином, білок-білкові взаємодії обумовлені поверхневою та внутрішньомембранною орієнтацією молекул білка (утворення кластерів).

Рекомендована література:

1.Рубин А.Б. Биофизика: учеб. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 2004. – Т.2 (Биофизика клеточных процессов). – 470 с. (глава ХVІ. Конформационные свойства мембран, §2. Особенности межмолекулярных взаимодействий в мембранах, стр. 57-61).

2.Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 с. (глава 5. Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия, стр. 204-242).

Контрольні запитання для засвоєння матеріалу:

1.Типи міжмолекулярних взаємодій та їх роль у стабілізації мембранних структур.

2.Охарактеризуйте особливості ліпід-білкової взаємодії.

70

Тема №10. «Застосування фізико-хімічних методів для дослідження біомембран»

Основні методичні прийоми:

1.розбирання нативної мембрани на складові елементи – солюбілізація;

2.повне або часткове збирання штучної мембрани з використанням усіх або частини компонентів вихідної мембрани – реконструкція.

60-і роки ХХ ст. – перші спроби з розділення мембран на окремі компоненти – функціональні одиниці. Впливи: механічна обробка, дія ультразвуку, використання органічних розчинників, хімічних агентів та ін.

На сьогодні для розділення мембран найчастіше використовують центрифугування. Мембрани та їх складові можна розділити за швидкістю їх седиментації, або за плавучою густиною. Перший метод носить назву зональне центрифугування: розділення відбувається у відповідності зі значенням коефіцієнту седиментації S. Інший метод – ізопікнічне центрифугування: розділення відбувається за умов рівноважної густини. Субклітинні компоненти будуть розміщуватись відповідно до густини і коефіцієнту седиментації. Так, наприклад, ядра мають відносно високі значення S, тобто швидкість їх седиментації є набагато більшою порівняно з більшістю субклітинних органел. Ядра можна вибірково осадити центрифугуванням клітинного гомогенату. При цьому інші органели залишаться у надосадовій рідині.

Часто для виділення різних мембранних фракцій з клітинного гомогенату використовують різницю в їх густині. Як вже зазначалось, проводять центрифугування за градієнтом густини. Для створення градієнту, як правило, використовують сахарозу, фікол, перкол, метризамід.

1.Фікол. Високомолекулярний (м.м. 400 кДа) гідрофільний полімер сахарози. Перевага – низький осмотичний тиск розчинів порівняно з розчинами

зеквівалентною концентрацією сахарози. Завдяки цьому можна створювати розчини, ізотонічні у всьому діапазоні концентрацій при додатковому введенні у розчини сахарози або прийнятних з фізіологічної точки зору солей. Недолік – висока в’язкість цих розчинів.

2.Метризамід. Трийодзаміщений бензамід глюкози (м.м. 789 кДа). Розчини мають більшу густину, ніж розчини фіколу за тих же концентрацій. Перевага – низька в’язкість розчинів, що дозволяє прискорити розділення.

3.Перкол. Колоїдна суспензія силікагелю, частинки якого вкриті полівінілпіроллідоном, внаслідок чого послаблюється токсичний вплив силікагелю. Перевагою є те, що перкол не проникає крізь мембрану, його розчини мають низьку в’язкість.

4.Сорбітол та маннітол. Ці речовини іноді використовують замість сахарози.

Солі лужних металів, наприклад CsCl, використовують також для створення градієнта густини, коли необхідні розчини з високою густиною.

Для виділення мембран з клітинних гомогенатів використовують й інші методи.