биофизика мембран укр

51

Штучні бішарові мембрани.

1.Моноламелярні ліпосоми. Більш ефективний вплив на грубі фосфоліпідні дисперсії (обробка ультразвуком) викликає утворення моноламелярних (одношарових) везикул (діаметр 20-40 нм). Моноламелярні ліпосоми широко використовують у різних практичних дослідженнях. Однак, незначний внутрішній об’єм та осмотична неактивність ліпосом є перешкодою у цьому. На сьогодні розроблені методики отримання великих (100 нм у діаметрі та більше) моноламелярних ліпосом, які не мають таких недоліків.

2.Мультиламелярні ліпосоми. Плоскі ламелярні структури проявляють схильність (при струшуванні) утворювати замкнені сферичні частинки. Цей процес енергетично вигідний, оскільки у цьому випадку досягається мінімум площі контакту гідрофобних поверхней з водою. За механічних дій утворюються багатошарові частинки (діаметр у кілька мкм) з концентричною організацією шарів – мультиламелярні ліпосоми або везикули. Ліпідні шари відокремлюють внутрішню водну фазу від зовнішнього розчину. Така організація дозволяє використовувати мультиламелярні ліпосоми для дослідження бар’єрних властивостей ліпідного бішару та ін. Мультиламелярні ліпосоми осмотично активні: вони змінюються в об’ємі при зміні осмотичних властивостей зовнішнього середовища.

3.Протеоліпосоми. Деякі мембранні білки і дрібні фрагменти біологічних мембран порівняно легко можуть бути включені до складу штучних везикулярних мембран. Ці комбіновані системи називаються протеоліпосомами. Ефективність вбудовування більшості білків у штучні мембранні системи залежить від ліпідного складу мембран, рН, температури, складу солей та ін. Як правило, ефективність вбудовування білкових молекул або ліпопротеїнових фрагментів зростає за присутності невеликих кількостей детергентів.

Цінність протеоліпосом, як штучних мембранних систем, визначається можливостями, які вони проявляють у дослідженнях функціонування багатьох важливих компонентів біологічних мембран. Замкненні мембранні пухирці утворюють фрагменти мембран саркота ендоплазматичного ретикулумів, внутрішньої мембрани мітохондрій за різних способів фрагментації біологічних мембран. У деяких випадках отримують везикули з оберненою орієнтацією мембран, що важливо для вивчення їх структурно-функціональної організації. На рис. 7.4 представлені різні види ліпосом.

4.Плоскі бішарові ліпідні мембрани. Ліпіди, які спонтанно утворюють ламелярні шари, здатні формувати бішарові структури (БЛМ або «чорні» плівки) на невеликих отворах у тонких гідрофобних матеріалах. Основні сили, які визначають поведінку плівки, є міжфазний (поверхневий) натяг та ван-дер- ваальсові сили притягання водних фаз по обидва боки плівки, що стискують плівку у поперечному напрямі, – розклинюючий тиск.

Початкова товщина ліпідної плівки перевищує 100 нм. За такої товщини розклинюючий тиск близький до нуля, а поведінка ліпідної маси визначається різницею гідростатичного тиску в її периферичній викривленій частині – торі – та у центральній порівняно плоскій частині.

52

Рис. 7.4. Різні види ліпосом: мультиламелярні везикули (МЛВ), великі моноламелярні везикули (ВМВ), оліголамелярні везикули (ОЛВ), малі моноламелярні везикули (ММВ), дископодібні ліпосоми (дискоми), тубулярні трубчаті везикули [10].

Відповідно до закону Лапласа, різниця гідродинамічного тиску р між фазою, яка знаходиться під вигнутою поверхнею розділу (у торі), та фазою над поверхнею визначається виразом

де R1 та R2 – внутрішній та зовнішній радіуси кривизни поверхні. Очевидно, що у центральній частині плівки, де радіус кривизни наближається до нескінченості (R1=R2→∞), р=0. Це означає, що у торі гідродинамічний тиск нижчий, ніж у плоскій частині мембрани. Внаслідок цього рідка мембраноутворююча фаза буде витискуватись із центральної частини у радіальному напрямі. Швидкість потоку, яка виникає, буде максимальною на периферії плівки на ділянках, які прилягають до тору, де лінійний градієнт гідродинамічного тиску максимальний. У зв’язку з цим плоска частина плівки швидше зменшується за товщиною по периферії, формуючи при цьому лінзоподібну структуру.

На ділянках, де товщина плівки становить менше 100 нм, значну роль відіграють сили взаємодії поверхневих шарів і водних фаз по обидва боки плівки. Сукупність цих сил або прискорює процес зменшення товщини плівки – від’ємний розклинюючий тиск, або перешкоджає цьому процесу – додатній розклинюючий тиск. Подальше зменшення товщини плівки призводить або до її розриву, або до стрибкоподібного формування стійкої бішарової структури. Формування бішарової структури завершується, коли вона поширюється на всю площу, безпосередньо контактуючи з тором. Формування бішарової структури відбувається протягом 5-20 хв і залежить від багатьох параметрів (ліпідний склад, температура, рН, іонна сила, склад розчинів та ін.).

53

Процес зменшення товщини плівки і формування БЛМ можна спостерігати у відбитому світлі. Коли товщина плівки стає співрозмірною з довжиною хвилі світла, яке падає, починає проявлятись інтерференція променів, відбитих від передньої і задньої поверхні плівки, і на поверхні мембрани виникають кільця Ньютона.

Ці небішарові плівки, які містять лінзоподібні потовщення, отримали назву кольорових плівок. Бішарові ліпідні структури у відбитому світлі є чорними на світлому фоні. Низька відбиваюча здатність цих плівок обумовлена тим, що різниця фаз між променями, які відбиваються від передньої і задньої поверхонь плівки, близька до π, тобто ці промені знаходяться у протифазі та гасять один одного.

Формування чорної бішарової мембрани не означає завершення усіх процесів формування БЛМ. Йде розтікання ліпідного розчину по поверхні перетинки, на якій сформовано мембрану, вихід розчинника з мембрани в об’єм тору та у водну фазу, а також ущільнення упаковки молекул ліпіду в моношарі та на поверхні тору. Ці процеси призводять до поступового зменшення поверхневого натягу і збільшення електричної ємності БЛМ до деяких стаціонарних значень.

За своїми електричними характеристиками і деякими фізико-хімічними властивостями бішарові ліпідні плівки наближаються до біологічних мембран. Немодифіковані штучні БЛМ мають низьку проникність. За присутності модифікаторів проникність мембран, як правило, зростає. Процес формування у клітинах замкнених везикул, як і в модельних системах, має характер спонтанної самоорганізації. Можливо, загальним етапом є самоорганізація моношару та формування на цій основі моноламелярних везикул, які потім перетворюються у мультиламелярні ліпосоми.

Визначення провідності та ємності бімолекулярних ліпідних мембран.

Для визначення електричних характеристик БЛМ використовують метод фіксації потенціалу (схему вимірювань зображено на рис. 7.5).

Рис. 7.5. Визначення електричних параметрів бімолекулярної фосфоліпідної мембрани: 1 – генератор імпульсів та джерело постійної напруги, 2 – електроди, що неполяризуються, 3 – перетворювач струм-напруга [12].

На отворі в тефлоновій перегородці формують мембрану, що розділяє два водних розчини, в які занурюють ідентичні електроди порівняння, що не поляризуються, з низьким опором. Один з електродів підключено до виходу

54

генератора електричних сигналів, інший – замкнено на землю через перетворювач струм-напруга. Напруга, що задається на виході генератора, повністю падає на мембрані, опір якої набагато більший опору електродів, електроліту та ефективного опору вимірювача струму.

Сигнал з виходу перетворювача струм-напруга реєструється осцилографом та самозаписуючим потенціометром. Пристрій дозволяє вимірювати струм через мембрану за фіксованих значень трансмембранної різниці потенціалів, а також при накладанні імпульсів напруги довільної форми.

Для формування БЛМ використовують розчини ліпідів мозку тварин у тетрадекані або інших рідких вуглеводах з довжиною вуглеводневого ланцюга від 6 до 16 атомів. Широко використовують також розчини азолектина (фосфоліпіди соєвих бобів), екстракти ліпідів з різних тканин, клітин та органел. До мембранного розчину додають іноді токоферол для підвищення стабільності мембран, або холестерол, який необхідний для формування іонних каналів в присутності амфотерицину. При нанесенні розчину фосфоліпідів на отвір в тефлоновій перегородці відбувається спонтанне витіснення розчинника до країв отвору БЛМ. По мірі розтікання фосфоліпідного шару в полі зору мікроскопу з’являються чорного кольору ділянки, виникнення яких пов’язане з таким зменшенням товщини БЛМ, яке за величиною стає значно меншим довжини хвилі світла, при якому відбувається спостереження. Збільшення площі ліпідного бішару супроводжується зростанням електричної ємності мембрани (СМ). Тому утворенням БЛМ зручно спостерігати за збільшенням ємнісного струму, який протікає через мембрану при накладанні на неї трикутних імпульсів напруги. Струм в електричному ланцюзі, елементом якого є БЛМ, складається з двох складових: омічної (ІR) та ємнісної (ІС):

де V – потенціал на мембрані, t – час.

При швидкому наростанні потенціалу струм через опір RM немодифікованої мембрани незначний у порівнянні з ємнісним струмом. За цих

ємнісного струму бішарових ліпідних мембран зручно спостерігати при підведенні до них трикутних імпульсів напруги. Значення ємності розраховують за формулою

де dV – швидкість зміни потенціалу на мембрані. dt

Періодичні коливання ємнісного струму певної форми подають на випрямлювач та отримують на виході постійний сигнал, або сигнал, що повільно змінюється, який є пропорційним ємності мембрани. Збільшення ємності в процесі формування БЛМ реєструють на самозаписуючому пристрої. Швидкість формування ліпідного бішара залежить від температури, рН середовища, складу мембранного розчину та інших факторів.

55

Немодифіковані БЛМ мають провідність 1-10 нСм/см2 та питому ємність 0,3-0,9 мкФ/см2. Визначення ємності на таких спрощених мембранах допускається лише в тих випадках, коли струм провідності набагато менше ємнісного струму.

При додаванні каналоформуючих іонофорів у значних концентраціях провідність БЛМ зростає на декілька порядків порівняно з немодифікованими БЛМ. При вимірюваннях у режимі фіксації напруги це проявляється у різкому збільшенні трансмембранного струму. Аналогічно можна реєструвати зміни провідності мембран за різних випливів, наприклад при освітленні БЛМ, що містять фоточутливий білок бактеріородопсин або екстракти фотосинтетичних пігментів.

Штучні БЛМ – модель для дослідження іонної проникності клітинних мембран (формування іонних каналів у ліпідному бішарі). Іонні канали, утворені антибіотиками. Іонофори, які підвищують провідність БЛМ, за механізмом дії поділяють на дві групи. До першої відносять валіноміцин та інші нейтральні макроциклічні антибіотики, які здатні зв’язувати іони лужних металів з утворенням ліпофільних позитивнозаряджених комплексів (рис. 7.6, А та Б). Завдяки високій ліпофільності вільних комплексонів та заряджених комплексів валіноміцин та його аналоги є ефективними переносниками іонів через БЛМ.

До іншої групи іонофорів відносять граміцидин, аламетицин та полієнові антибіотики, що утворюють в БЛМ іонні канали. При внесенні цих антибіотиків у низьких концентраціях у водні розчини з обох сторін БЛМ з’являються дискретні флуктуації струму, амплітуда яких значно перевищує значення фонового струму через немодифіковані мембрани. Фонова провідність БЛМ малого діаметра (50-200 мкм) не перевищує кількох пікосіменс. Стрибки ж струму, що індукуються граміцидином А, відповідають провідності близько 30 пСм. Дискретні флуктуації струму приблизно рівні за величиною і складають кілька пА за напруги на мембрані 50-100 мВ. Появу дискретних стрибків провідності за присутності іонофорів прийнято пояснювати утворенням трансмембранного каналу з двох або декількох субодиниць. Наприклад, молекули граміцидину А, потрапляючи в мембрани, згортаються у напівпору – спіральну структуру, розміром близько 3 нм (рис. 7.6, В).

Напівпори орієнтуються перпендикулярно площині мембрани, утримуючись полярним кінцем на межі з водним розчином. Спіральна конфігурація молекули має внутрішню порожнину, в яку обернені полярні групи. Стан провідності виникає при випадковому утворенні димерної структури, стабілізованої міжмолекулярними водневими зв’язками. Зворотній стрибок провідності пояснюють розпадом димера внаслідок дестабілізуючого впливу теплових коливань. Дискретні стрибки провідності можуть бути також викликані локальними змінами товщини БЛМ, поворотом димера в мембрані та іншими причинами.

Провідність каналу залежить від концентрації солей в середовищі, тому завжди вказують склад розчинів. Стрибки струму через поодинокий канал з провідністю 30 пСм за напруги на мембрані 50 мВ складають 1,5 пА. Оскільки

56

елементарний заряд дорівнює 1,6 10–19 Кл, пропускна здатність іонного каналу складає 107 іонів/с.

Рис. 7.6. Індукований іонний транспорт: А – транспорт іонів калію через мембрану за схемою переносників (V – рухливий носій валіноміцин, KV – комплекс валіноміцину з калієм); Б – структура комплексу К+–валіноміцин; В – структура утвореного граміцидином А каналу [13].

Вивчення іонних каналів, які утворюються пептидними антибіотиками, визначило інтерес до спроб реконструкції іонних каналів біологічних мембран у ліпідному бішарі. Дослідження поодиноких каналів дає значно більше інформації, ніж мембран з великим числом каналів. Так, вимірювання струмів поодиноких каналів дає пряму інформацію щодо провідності та часу відкритого стану каналу, а також про вплив потенціалу і хімічних агентів на ці параметри.

Реконструкція іонних каналів в БЛМ повинна включати три основні етапи: екстракцію каналів з нативних мембран за допомогою детергентів або розчинників, наступне очищення мембранних білків та їх вбудовування у мембранний бішар. Такі реконструйовані системи дають можливість досліджувати роботу поодиноких іонних каналів за різних модифікацій ліпідного складу мембрани.

Рекомендована література:

1.Антонов В.Ф. Биофизика мембран // Сорос. образов. журн. – 1996. – №6. – С. 4-12.

2.Антонов В.Ф., Черныш А.М., Пасечник В.И., Вознесенский С.А., Козлова Е.К. Биофизика: учеб. – М.: Владос, 2003. – 288 с. (глава 1. Биологические мембраны, §5. Модельные липидные мембраны, стр. 28-30).

3.Барсуков Л.И. Липосомы // Сорос. образов. журн. – 1998. – №10. – С. 2-9.

4.Брик Т.М. Енциклопедія мембран: у 2 т. – К.: Вид. дім «Києво-Могилянська академія», 2005. – Т.1. – 658 с. (стор. 471-473 та 598-600).

5.Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 с. (глава 2. Структура и свойства мембранных липидов, §2.2. Водно-липидные смеси, стр. 54-72; §2.3. Термодинамика полиморфизма липидных структур, стр. 7284; §2.5. Модельные мембранные системы, стр. 96-108).

6.Зима В.Л. Біофізика: Збірник задач: навч. посіб. – К.: Вища школа, 2001. – 124 с.

57

7.Зленко Д.В., Красильников П.М. Молекулярное моделирование липидных бислойных мембран // Компьютерные исследования и моделирование. – 2009. –

Т.1, №4. – С. 423-436.

8.Камкин А.Г., Киселева И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток: уч. пособие. – М.: Изд. центр «Академия», 2008. – 592 с. (1.5. Искусственные мембаны, стр. 31-34).

9.Костюк П.Г., Зима В.Л., Магура И.С., Мірошниченко М. С., Шуба М.Ф. Біофізика: підруч. – К.: Обереги, 2001. – 544 с. (розділ 8. Фізико-хімічні механізми виникнення мембранного потенціалу, §8.4. Моделювання іонної проникності клітинних мембран, стор. 262-266).

10.Остапченко Л.І., Михайлик І.В. Біологічні мембрани: методи дослідження структури і функцій: навч. посіб. – К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2006. – 215 с. (розділ 1. Особливості структури клітинних мембран і методи їх вивчення, §4. Модельні мембранні системи, стор. 110-138).

11.Рыбальченко В.К., Коганов М.М. Структура и функции мембран: Практикум. – К.: Вища школа, 1988. – 312 с. (глава ІІ. Обзор основных методов и методических подходов, используемых в исследовании мембранных структур, §2.4. Искусственные мембраны, стр. 127-138; глава ІІІ. Практические работы, §3.19. Формирование бимолекулярных липидных мембран и изучение их электрических характеристик, стр. 283-286; §3.20. Исследование липосом, стр. 286-288).

12.Рубин А.Б. Биофизика: учеб. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 2004. – Т.2 (Биофизика клеточных процессов). – 470 с. (глава ХV. Молекулярная организация биологических мембран, §2. Образование мембранных структур, стр. 13-18; глава ХХ. Индуцированный ионный транспорт, стр. 104-110).

13.Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин // Сорос. образов. журн. – 2000. – Т.6, №8. – С. 12-17.

14.Шиманський Ю.І., Шиманська О.Т. Молекулярна фізика: навч. посіб. – К.: Видавничий дім «Києво-Могилянська академія», 2007. – 462 с. (розділ 7, §7 «Явища на границі поділу різних середовищ», стор. 293-297).

15.Шуба М.Ф., Давидовська Т.Л., Прилуцький Ю.І., Жолос О.В., Богуцька К.І. Електробіофізика: навч. посіб. – К.: Фітосоціоцентр, 2002. – 152 с.

16.Bioelectrochemistry of membranes / Walz D., Teissie J., Milazzo G., eds. – Birkhauser, Basel–Boston–Berlin, 2004. – 240 p. (глава 5).

Контрольні запитання для засвоєння матеріалу:

1.Бішарові ліпідні мембрани: їх функціональні характеристики.

2.Моделювання іонної проникності на штучних мембранах. Транспортні антибіотики.

3.Як валіноміцин модифікує іонну провідність штучних мембран?

Задачі.

1.Скільки молекул фосфоліпідів знаходиться у сферичній бішаровій ліпосомі радіусом 20 нм, якщо одна молекула фосфоліпіду займає площу 0,5 нм2.

2.На поверхню води в циліндрі радіусом 10 см виливається 0,5 мл 0,01 %-ного розчину олеїнової кислоти в бензолі. За короткий час бензол випаровується і молекули кислоти утворюють мономолекулярну плівку на всій поверхні води.

Визначити довжину та площу поперечного перерізу молекули олеїнової кислоти в моношарі (Мол.кис.=282,3, ρол.кис.=898 кг/м3, ρбенз.=880 кг/м3) (літ.: [6], №6.2, стор. 43).

58

3.Штучна ліпідна мембрана товщиною 8 нм ділить камеру на дві частини. Різниця концентрації метиленового синього с=4 10-3 моль/л по обидва боки мембрани створює потік цієї речовини 12 10-6 моль/с м2. Знайти коефіцієнт дифузії і

коефіцієнт проникності метиленового синього через штучну ліпідну мембрану, якщо коефіцієнт розподілення β=5 10-3 (літ.: [6], №7.17, стор. 51).

4.У тефлоновій пластинці, яка розділяє систему на два відсіки, є отвір радіусом 1 мм, який вкриває бішарова ліпідна мембрана. При 27 оС іони натрію розподілились так: з одного боку мембрани 5 10-2 моль/л, а з іншого – 10-3 моль/л. Питома ємність мембрани становить 5 104 мкФ/м2. Знайти електричний заряд мембрани (літ.: [6],

№8.15, стор. 63).

5.Клітина сферичної форми радіусом 8 мкм має питому ємність мембрани 0,8 мФ/м2. За допомогою мікроелектроду виміряно мембранний потенціал –85 мВ. Визначити кількість іонів, яка проходить крізь мембрану при створенні такого мембранного потенціалу.

Самостійно розглянути такі теми:

1)«Фізико-хімічні характеристики ліпідних моношарів»;

2)«Ліпосоми – модель дослідження мембран. Можливе використання в медицині ліпосом та везикул» (літ.: [3]);

3)«Протеоліпосоми як модель вивчення механізму енергетичного спряження»;

4)«Дослідження адсорбції лігандів на бішарі» (літ.: [5], глава 7, §7.1, стор. 289-297);

5)«Електричні параметри бішарових ліпідних мембран».

Тема №8. «Злиття біомембран»

Основною функцією біологічних мембран є відокремлення клітин і органел від оточуючого середовища. Мембрани підтримують клітину в нерівноважному стані, забезпечуючи збереження перепадів концентрацій і електричного потенціалу. Вільна енергія, яка запасається у клітині або внутрішньоклітинних органелах, витрачається на здійснення багатьох життєво важливих функцій – від генерації і поширення нервового імпульсу до хімічного синтезу і виконання механічної роботи. Руйнування плазматичної мембрани призводить до загибелі клітини. У той же час у живій клітині постійно відбуваються трансформації біомембран, які супроводжуються локальними і тимчасовими порушеннями їхньої цілісності та замиканням з утворенням нових структур. Ці процеси, які називаються злиттям і поділом мембран, відбуваються при екзота ендоцитозі, поділі клітин, запліднені, утворенні багатоядерних клітин при диференціюванні, інфікуванні оболонковими вірусами. Штучно викликане злипання мембранних утворень використовують для вирішення багатьох біотехнологічних та біомедичних завдань. Важливо зазначити, що, не дивлячись на різноманітність явищ злиття, між ними є багато спільного.

Злиття мембран при екзоцитозі. Розглянемо процес екзоцитозу на прикладі тучних клітин, які секретують гістамін, гепарин і серотонін. Ці клітини і гранули, які в них знаходяться, настільки великі, що за допомогою електронної мікроскопії можна спостерігати весь перебіг екзоцитозу (рис. 8.1). У вихідному стані маємо клітину та секреторну гранулу (стан 1), яка відділена

59

від плазматичної мембрани. Як відповідь на певний чинник, гранула контактує з плазматичною мембраною (стан 2).

Рис. 8.1. Схематична ілюстрація процесу екзоцитозу: А – показані клітина та секреторна гранула (1), білки злиття (2) та пора злиття (3); Б – електронна мікрофотографія пори злиття, мембрани формують димпл [6].

У зоні контакту плазматична мембрана вигинається у бік гранулярної мембрани, утворюючи так званий димпл, вершина якого представляє собою достатньо викривлену мембрану. На цій ділянці (порядку 10 нм) ліпідні домени гранулярної і плазматичної мембран знаходяться у контакті. Ймовірно, саме тут відбувається злиття мембран і утворення пори злиття (стан 3), яка забезпечує можливість виходу вмісту гранули в оточуюче середовище. Отже, злиття – це об'єднання мембран і встановлення зв'язку через пору злиття між внутрішнім простором і позаклітинним середовищем. На електронних мікрофотографіях вдається побачити лише достатньо великі пори (близько 50 нм у діаметрі). Стінки цих пор утворені вигнутими ліпідними бішарами. Поблизу пори є білкові макромолекулярні структури, у тому числі ниткоподібні утворення, побудовані з актину. Можливо, саме вони сприяють утворенню димплів.

На жаль, за допомогою електронної мікроскопії не вдається зареєструвати малу пору, щоб з’ясувати механізм її утворення у процесі перезамикання вихідних мембран. Нові можливості для цього з'явились після того, як був розроблений метод петч-клампа (відведення струму за допомогою мікропіпетки). Скляну мікропіпетку притискають до плазматичної мембрани доти, поки не утворюється щільний контакт, який забезпечує електричну і хімічну ізоляцію внутрішнього вмісту від оточуючого розчину. Шматочок мембрани, який знаходиться на кінчику піпетки, руйнується, внаслідок чого виникає електричний і хімічний доступ всередину клітини. Підсилювач струму, увімкнений між двома електродами, один з яких знаходиться у піпетці, а інший

– в оточуючому клітину розчині, дозволяє підтримувати заданий мембранний потенціал та вимірювати електричний струм, який складається з омічної та ємнісної компонент. Остання відповідає за перенесення іонів, які необхідні для зарядження мембрани до певного потенціалу. Загальний перенесений заряд пропорційний площі мембранного конденсатора. Це означає, якщо з

60

плазматичною мембраною зливається гранула, що перебуває у цитоплазмі, і тим самим збільшується сумарна площа клітинної поверхні, тоді цей ефект може бути зафіксований методом петч-клампа шляхом реєстрації ємнісного струму.

Зарядка мембранного конденсатора гранули відбувається через пору злиття, провідність якої визначає кінетику ємнісного струму. Реєструючи цей струм як функцію часу, можна встановити, як саме змінюється радіус пори. Вимірювання ємності гранули на стадії швидких переходів між відкритим та закритим станами пори показали, що площа гранули за цей час помітно зростає. Це відбувається внаслідок перенесення 10 ліпідних молекул з плазматичної мембрани у мембрану гранули. Звідси випливає, що стінки найменших пор вкриті ліпідами, які забезпечують зв'язок системи за ліпідною компонентою і значний ліпідний потік, рушійною силою якого є, ймовірно, різниця натягів між плазматичною мембраною та мембраною гранули. Ці результати можуть бути додатковим аргументом на користь припущення, що злиття мембран відбувається на ділянці вершини димплу. Стінки пори злиття, яка утворюється, включають до свого складу ліпіди і, можливо, якісь інші білки, що беруть участь у процесі злиття. Ймовірно, що формування щільного локального контакту мембран – це функція білка. Далі виникає запитання: чи достатньо звести ліпідні бішари на близьку відстань, щоб вони самодовільно злилися? Відповісти на нього вдалося за допомогою досліджень БЛМ.

Злиття плоских бішарових ліпідних мембран. Плоскі БЛМ є зручною і ефективною моделлю, яка допомогла вирішити багато питань біофізики мембран. Плоску БЛМ, як правило, формують у комірці, що складається з двох камер, розділених тонкою тефлоновою перетинкою, у якій є отвір діаметром порядку 1 нм. Комірку заповнюють розчином електроліту, в камери вводять електроди, на перетинку в ділянці отвору наносять краплину розчину фосфоліпідів в органічному розчиннику. Краплина самодовільно розтікається, при цьому надлишок ліпідів і розчинник витискуються на край отвору, формуючи так званий меніск. У центрі отвору утворюється ліпідний бішар товщиною близько 4 нм. Для вивчення злиття мембран замість одного бішару формують два, які розміщені співвісно. Це реалізують за допомогою трикамерної комірки (рис. 8.2).

Мембрани М1 та М2 формуються на отворах у перетинках, стрижні 4 та 5 дозволяють підвищувати тиск у відсіках І та III, тим самим витісняючи бішари назустріч один одному. У всіх відсіках знаходяться електроди, підключені до вимірювальної апаратури, яка реєструє омічний та ємнісний струми, а також вимірює густину поверхневого заряду будь-якого моношару до та після злиття. Площу моношарів визначають за допомогою оптичного мікроскопа. Витискування мембран назустріч одна одній з вихідного положення (рис. 8.3, стан 1) за допомогою перепаду гідростатичного тиску призводить до поступового зменшення товщини водного прошарку між ними до встановлення рівноважного плоско-паралельного контакту (рис. 8.3, стан 2). У цьому випадку гідростатичний тиск і молекулярне притягування, що зближує бішари,