Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення гідроксипроліну (оксипроліну) у сечі.

Принцип методу: метод базується на окисненні гідроксипроліну до сполуки, близької за будовою до піролу, яка при конденсації з реактивом Ерліха (п-диметиламінобензальдегід) дає рожеве забарвлення. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації гідроксипроліну.

Матеріальне забезпечення: реактив Ерліха, 3 н розчин сірчаної кислоти, 6 % розчин гідрогену пероксиду, 2,5 н розчин натрію гідроксиду, 0,01 М розчин міді сульфату, водяна баня, ФЕК, мірні піпетки, пробірки, лійка, фільтрувальний папір.

Хід роботи. У першу пробірку відміряють 1мл профільтрованої сечі, у другу – 1мл дистильованої води (контрольна проба). В обидві пробірки додають по 1 мл 0,01 М розчину міді сульфату, по 1мл 2,5 н розчину натрію гідроксиду, по 1мл 6 % розчину гідрогену пероксиду. Проби перемішують 5 хв, після чого нагрівають 3 хв у киплячій водяній бані, потім пробірки охолоджують водою з-під крану. У пробірки додають по 4 мл 3 н розчину сірчаної кислоти і по 1 мл реактиву Еріха, ставлять на 1 хв у кип’ячу водяну баню, охолоджують, а потім вимірюють оптичну густину на ФЕКу проти контролю при довжині хвилі  = 500 – 560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі завтовшки 10 мм.

За калібрувальним графіком визначають вміст гідроксипроліну в дослідній пробі і розраховують кількість гідроксипроліну, виділеного з сечею впродовж доби за формулою:

де а – кількість гідроксипроліну, знайдена за калібрувальним графіком; Vдоб. – добовий об’єм сечі, мл; V проби – об’єм сечі, взятий для аналізу, мл.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок

Клініко-діагностичне значення. Вміст гідроксипроліну в сечі та крові характеризує інтенсивність катаболізму колагену та швидкість обміну цієї амінокислоти. Гідроксипролін може знаходитись у зв’язаному з білками та пептидами стані, а також у вільному стані як у сироватці крові, так і в сечі. У 10 – 20-річному віці з сечею виділяється до 200 мг гідроксипроліну за добу, а у дорослих – 15 – 50 мг. Зростання цього показника спостерігають при колагенозах (ревматизм, ревматоїдний артрит, системна склеродермія, дерматоміозит), при гіперпаратиреоїдизмі, хворобі Педжета (до 1г за добу). Ще більше виділяється гідроксипроліну при спадковій гіпергідроксипролінемії, що спричинено дефектом ферменту гідроксипроліноксидази, у результаті чого порушується обмін гідроксипроліну.

Дослід 2. Якісна реакція на глікозаміноглікани (проба Беррі-Спінанджера).

Принцип методу. При взаємодії глікозаміногліканів з толуїдиновим синім у кислому середовищі утворюється червоне забарвлення (метахромазія).

Матеріальне забезпечення: толуїдиновий синій (0,04 % розчин в ацетооцтовому буфері з рН = 2,0), 10 % розчин ацетатної кислоти, фільтрувальний папір, мікропіпетки.

Хід роботи. На смужку фільтрувального паперу на віддалі 1 см один від одного наносять мікропіпеткою 0,005, 0,01 і 0,025 мл сечі, висушують папір при кімнатній температурі, а потім занурюють його на 1 хв у 0,04 % розчин толуїдинового синього . Виймають смужку паперу і відмивають реактив 10 % розчином ацетатної кислоти. Якщо концентрація глікозаміногліканів у досліджуваній сечі перевищує 10 мг/100 мл, тоді з’являється червоне забарвлення на одній із нанесених плям.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У сечі здорової людини міститься 2,7 – 7,5 мг/добу кислих глікозамінгліканів (хондроїтинсульфати А і С). Негативну реакцію спостерігають у здорової дитини вже на 2-ий тиждень життя. При гаргоїлізмі суттєво (до 30 – 80 мг/добу) підвищується виділення глікозаміногліканів із сечею (мукополісахаридурія) .

контроль виконання лабораторної роботи

1. У крові та сечі жінки віком 63 роки, яка хворіє на ревматизм, підвищена концентрація оксипроліну. Що є основною причиною гіпероксипролінемії?

А. Активація пролілгідроксилази

В. Деградація колагену

С. Порушення функції нирок

D. Активація катепсинів

Е. Деградація гіалуропротеїну

2. До фібрилярний елементів сполучної тканини належать колаген, еластин і ретикулін. Вкажіть амінокислоту, яка входить тільки до складу колагену, і визначення якої в біологічних рідинах використовують для діагностики захворювань сполучної тканини?

A. Гідроксипролін

B. Гліцин

C. Фенілаланін

D. Пролін

E. Лізин

3. Пацієнт обстежується в клініці з приводу підозри на колагеноз. Цю патологію можна підтвердити за умови збільшення в крові:

A. Вмісту оксипроліну та оксилізину

B. Активності ізоферментів ЛДГ

C. Вмісту креатину та креатиніну

D. Вмісту уратів

E. Активності трансаміназ

4. У хворих на колагеноз спостерігається деструкція сполучної тканини. Які дослідження лабораторних показників крові та сечі доцільно призначити хворому з підозрою на наявність колагенозу (хронічна форма)?

A. Вмісту оксипроліну та оксилізину в крові та сечі

B. Активності ізоензимів ЛДГ крові

C. Вміст уратів в крові

D. С-реактивного білка в крові

E. Активності трансаміназ крові

5. Деякі патогенні мікроорганізми здатні руйнувати гіалуронову кислоту, виділяючи ензим гіалуронідазу. У чому полягає їх перевага перед мікробами, які не виявляють гіалуронідазної активності?

6. Пацієнт з опіковою хворобою перебуває під загрозою утворення тромбів у кровоносних судинах через посилення згортання крові. Який глікозаміноглікан можна використати, щоб запобігти утворенню тромбів?