Определение аммиака
Реагенты: 1% спиртовой раствор фенолфталеина, 0,1 и раствор едкого натра, формалин.
Ход определения. Для исследования на аммиак кал берут из прямой кишки 10 г кала -заливают 100 мл дистиллированной воды, хорошо смешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Затем к 25мл фильтрата добавляют 5—10 капель 1% спиртового раствора фенолфталеина и титруют из бюретки 0,1 и раствором едкого натра до появления розового окрашивания. Количество израсходованной на титрование щелочи умножают на 4: полученное число соответствует содержанию аммиака в 10 г кала. У здоровых овец, коз содержание аммиака составляет 2-— 4 ед.
Более точные сведения о соотношении бродильных и гнилостных процессов в кишечнике получают путем определения в кале органических кислот и аммиака по Гуаффону и Ру. В норме содержание органических кислот выражается сяедующей величиной: у лошади-12 мл (С. Н. Болховитинов): у телят (по данным А. М. Смирнова) однолневного возраста-2,7 (1,2-6,4 мл, в возрасте 2-15 дней-7,8 (2,4-22) мл; в возрасте -15-30 дней-8,1 (2,0-15,6) мл; в возрасте старше 30 дней-9,9 (4,0-19,0) мл, у собак-7,9-18,0 мл (А. Х. Шайхаманов). Содержание аммиака соответствует у лошади 2-3 мл (С. Н. Болховитинов); у телят (по данным А. М.- Смирнова) однодневного возраста-2.4 (1,0-3.6) мл; в возрасте 2-15 дней-6,4 (1,6-12,0) мл; в возрасте 15-30 дней-5.6 (2,8-10,8) мл; в возрасте старше 30 днен-2,3 (0,6-6.0) мл; у собак 3.2-8,0 мл (А. X. Шайхаманов). Увеличение содержания органических кислот свидетельствует об усилении процессов брожения, аммиака - (процессов гнилостного распада белка в кишечнике. При диарее количество органических кислот и аммиака может уменьшится, в таких случаях о преобладании процессов брожения или гниеиия судят но соотношению количества органических кислот и аммиака (А М. Смирнов).
Для выяснения вопроса о том, полностью ли прекратилось поступление желчи в кишечник или только уменьшино, ставят реакцию на стеркобилин и другие желчные пигменты. Проба на билирубин может быть положительной у здорового молодняка в первые дни жизни; у молодняка же более старшего возраста и у взрослых животных билирубин может быть при энтерите, при дисбактериозе (после лечения антибиотиками).
Обнаружение крови к кале имеет большую диагностическую ценность при тромбоэмболических коликах, травматическом ретикулите, кокцидиозе и др. Цвет кала меняется только при обильных кровотечениях; малые, скрытые примеси крови определяются химическими пробами; наиболее чувствительной из них является бензидиновая проба.
Методика.
Определение крови и билирубина в фекалиях. Это исследование особенно важно в тех случаях, когда имеется подозрение на наличие так называемой скрытой крови (гемоглобина и его дериватов), «ускользающей» при макро- и микроскопическом исследовании. Дня определения крови и билирубина в фекалиях применяют следующие пробы.
1.Бензидиновая проба. На предметное стекло наносят фекалии толстым слоем, добавляют 2-3 капли свежеприготовленного раствора бензидина в уксусной кислоте (берут на кончик ножа небольшое количество бензидина и растворяют в 5 мл ледяной уксусной кислоты) и столько же 3%-ного раствора перекисиси водорода. Перемешивают стеклянной палочкой. При положительной реакции на кровь появляется сине-зеленое окрашивание в течение первых 2 мин. Окрашивание, появившееся после 2 мин, не учитывают. Проба выявляет незначительное содержание крови (0,2%) в фекалиях.
2. Проба на стеркобилин с уксуснокислым цинком (по Шлезингеру). Комочек фекалий растирают приблизительно с 10- кратным объемом дистиллированной воды, приливают равное количество реактива Шлезингера (10 г ацетата цинка, растворенного и 90 мл 96° алкоголя) и несколько капель раствора Люголя. Фильтруют, фильтрат дает зеленую флюоресценцию, которая лучше видна на черном фоне.
3. Проба Фуше на билирубин. Комочек фекалий растирают с дистиллированной водой в соотношении 1:20 и добавляют по каплям реактив Фуше (25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл 10 %-ного раствора полуторахлористого, или хлорного железа) в количестве, не превышающем объем эмульсии. В присутствии билирубина появляется зеленое или синее окрашивание.
Билирубин в фекалиях может быть у здоровых животных в первые дни жизни, у молодняка более старшего возраста и у взрослых животных он может содержаться при энтеритах, дисбактериозах (после лечения антибиотиками).
Определение реакции на белковую экссудацию проводят по методу Трибуле—Вшинякова: нахождение в кале растворимого белка свидетельствует об усилении его выделения кишечной стенкой, что имеет большое диагностическое значение. Наличие растворимого белка свидетельствует о воспалительных процессах слизистой оболочки кишечника.
Для определения функционального состояния кишечника при
Диспепсии и гастроэнтероколите у телят, по данным И. В. Никишиной, имеет значение определение активности энтерокиназы и щелочной фосфатазы в кале (но Шлыгину, Фоминой и Михлину), при этом в продромальный период, а особенно в период выраженной болезни, активность ферментов резко увеличивается, что дает возможность использовать этот тест также для ранней диагностики названных болезней.
Методичка.
Определение реакции на белковую экссудацию. Готовят 3%-ную эмульсию фекалий (3 г фекалий с 100 мл дистиллированной воды, растирают в ступке). В 3 пробирки разливают эмульсию по 15 мл. В первую пробирку наливают 2 мл насыщенного раствора сулемы (7 г сулемы растворяют в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, яд!) или 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, во вторую – 2мл 20%-ного раствора уксусной кислоты и в третью, контрольную, - 2 мл дистиллированной воды. Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего отмечают степень просветления жидкости над осадком, сравнивая с контрольной пробиркой. Учет реакции и ее оценка таковы: полное просветление (+++++) реакция резко положительная,
значительное просветление (+++) - реакция положительная; незначительное просветление (+) - реакция слабоположительная и одинаковое с контролем помутнение - - реакция отрицательная.
Просветление в первой пробирке указывает на наличие сывороточного белка, (растворимого белка), что свидетельствует о воспалительных процессах слизистой оболочки кишечника. Просветление во второй пробирке свидетельствует об увеличении содержания слизи - муцина.
По реакции к пробирке с раствором сулемы можно судить о содержании стеркобилина и билирубина. При наличии стеркобилина появляется розовое, а билирубина - зеленое окрашивание. В пробирке с трихлоруксусной кислотой при выявлении билирубина также получается зеленое окрашивание. Содержание стеркобилина и билирубина можно оценивать в пятибалльных плюсовых единицах. При этом минимальный балл ( + ) ставят, когда единичные частицы фекалий окрашены в зеленый (розовый) цвет, максимальный балл (+++++), когда весь кал имеет зеленый (кирпично-красный) цвет. Отсутствие окрашивания обозначают знаком минус.
Ферменты
В кале содержится ряд ферментов. Наибольшее практическое значение, имеет определение энтерокиназы и щелочной фосфатазы, количественное определение которых используется как биохимический тест для оценки деятельности кишечника.
Определение щелочной фосфатазы (но Фоминой, Михлину, Шлыгину). Щелочная фосфатаза - характерный кишечный фермент, присутствующий в ферменте и слизистой оболочке тонкой кишки в больших количествах. В других пищеварительных секретах фермента содержится мало.
Принцип. В качестве субстрата используют фенолфталеинфосфат натрия, при инкубации которого с ферментом освобождается фенолфталеин, дающий красную окраску в щелочной среде. Появившаяся окраска визуально сравнивается с окраской стандартного щелочного раствора фенолфталеина. Определение проводится в условиях, оптимальных для действия щелочной фосфатазы в присутствии активатора (0,001 М Мg+, при температуре 37° и при рН 10,0).
Реактивы. 1. 0.1% раствор фенолфталеинфосфата натрия в 0,1 и аммиачном буфере рН 10,1. Для приготовления буфера смешивают 1 объемную часть 0,1 н раствора хлорида аммония (NH4Cl) и 4 части 0,1 н раствора аммиака (проверенного титрометрически). Исходные для буферной смеси растворы удобнее приготовлять и сохранять в виде 1 н концентрации и перед употреблением разбавлять в 10 раз. 2. 1.5% раствор сульфата магния. 3. Стандартный раствор фенолфталеина: смесь 1 мл 0,05% полуспиртового раствора (50 частей спирта + 46 частей воды) фенолфталеина, 1 мл 0.1 н раствора аммиака и 4 мл 0,1 и раствора хлорида аммония. Слепень окраски раствора проверяют в фотоэлектроколориметре. Оптическая плотность при зеленом светофильтре и толщине слоя 1 см должна быть 0,17-0,19. Стандартный раствор сохраняют в темном месте в посуде, не подвергшейся выщелачиванию, в течение 1-2 нед. 4 Этиловый спирт.
Оборудование. 1, Термостат на 37-38°. 2. Центрифуга на 2500--3000 об/мин. с центрифужными стаканами емкостью 10-25 мл. 3.Ступки фарфоровые емкостью 50-100 мл. 4. Градуированные пипетки емкостью 2,5 и 10 мл. 5. Пробирки и штативы. 6. Кварцевый песок. 7. фотоэлектроколориметр.
Ход определения. Готовят вытяжку из фекалий 1:10 (см. определение энтерокиназы). Степень разведения вытяжки зависит от ожидаемых результатов анализа. При исследовании фекалий взрослых берут разведение 1:30 (1 часть вытяжки и 2 части дистиллированной воды). При исследовании фекалий детей первых 2-3 лет жизни разведение 1:200 или 1:1000, т. е. вытяжку дополнительно разводят в 20 или 100 раз. Определение начинают с ориентировочной пробы: к 0,5-1 мл вытяжки добавляют равный объем раствора фенолфталеинфосфата в аммиачном буфере (реактив №1). Если в течение 2мин появляется значительное розовое окрашивание то вытяжку разводят дополнительно в 10 раз и снова испытывают тем же образом. В случае появления розовой окраски разводят вновь. Отсутствие окраски в течение 2 мин свидетельствует о достаточной степени разведения материала (исходное разведение).
Для исследования берут 8-10 пронумерованных пробирок из бесцветного стекла одинакового диаметра. И каждую пробирку, за исключением первой, наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку наливают 1 мл исследуемого раствора в исходном разведении, установленном в ориентировочной пробе. Во вторую пробирку наливают 2 мл исследуемого раствора и хорошо перемешивают с водой, набирая в пипетку жидкость, и выдувая обратно. После этого 2 мл смеси из второй пробирки переносят и третью и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 2 мл жидкости отбрасывают. Таким образом, получают ряд разведений с уменьшением количества ферментного материала в каждой пробирке на 1/3. Во вес пробирки добавляют но капле 1,5% раствора MgSO4 (реактив № 2), служащего активатором, и по 1 мл реактива № 1. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помещают в термостат при 37° С на час. По истечении времени наблюдается постепенное изменение окраски от интенсивно-красной на одном краю до полного отсутствия красного окрашивания на другом. Поднося пробирку со стандартным раствором фенолфталеина (2 мл), находят степень окраски в ряду, равную стандартной.
Количество фермента, вызывающее в описанных выше условиях появление такой окраски, принято за единицу фосфатазы.
Расчет. Количество единиц фосфатазы в 1 г исследуемого материала по формуле: Е=Р/а , где а - количество разведенной вытяжки в пробирке со стандартной окраской, Р - предварительное разведение материала.
Клиническое значение. В фекалиях здоровых взрослых людей щелочная фосфатаза содержится в количестве до 450 ед/г. Увеличение ее в фекалиях, так же как и увеличение содержания энтерокиназы, связано с изменением функции толстых кишок и деятельности микрофлоры. При кишечных заболеваниях иногда отмечают 1500-3000 ед/г щелочной фосфатазы. Повышение количества их ферментов указывают на более тяжелые нарушения функции кишечника. У детей содержание щелочной фосфатазы в фекалиях выше, чем у взрослых. У новорожденных оно составляет в среднем 4500 ед/г, у детей в возрасте около года - 5000-20000, в среднем 12000 ед/г, далее оно уменьшается и в возрасте 10-12 лег находится на том же уровне, что и у взрослых.
Определение энтерокиназы ( по Г.К. Шлыгину ).
Энтерокиназа - специфический кишечный фермент, вырабатываемый слизистой оболочкой тонких кишок, катализирующий превращение трипсиногена в трипсин.
Принцип. В основу метода положено активирование энтерокиназой неочищенного препарата трипсиногена. Способность воздействовать на трипсиноген в его естественном виде в присутствии, ингибитора трипсина за короткое время — несколько десятков минут -является специфическим проявлением действия энтерокиназы.
.Активирование проводят в стандартных условиях с использованием ряда возрастающих разведений исследуемого материала. Находят максимальное разведение материала, которое еще обусловливает определенную интенсивность действия энтерокиназы: вызывает триптическую активность, достаточную для переваривания казеина, в отличии от его створаживания.
Реактивы. 1. Препараты трипсиногена (сухой препарат поджелудочной железы кормов, специально приготовленный для данной цели) выпускаются, Московским мясокомбинатом. Могут быть приготовлены в лаборатории. 2. Очищенный казеин готовят путем двукратного растворения в аммиаке (без нагревания) и осаждения уксусной кислотой. 3. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,16); смесь 3 объемных частей 0,2 М KH2PO4 и 7 частей 0,2 М Nа2НРO4. 4. 0.7 н аммиачный буфер рН 8.9: смесь 1 объемной части 0,7 н раствора аммиака (проверенного титрометрически) с 4 частями 0.7 н раствора NH4Cl. Буфер можно хранить 1-2 недели. 5. 5% раствор казеина, содержащий кальций. Готовят каждый раз в день проведения определения. На одно определение энтерокиназы требуется 0,75-1 г очищенного казеина (указанного выше). На 1 г казеина берут 1,1 мл 1,15% раствора молочнокислого кальция и 9 мл 0.1 н раствора аммиака (проверенного титрометрически). Казеин заливают раствором молочнокислого кальция, тщательно перемешивают, добавляют аммиак и после растворения казеина раствор помещают на холод при температуре от О до 4°С.
Оборудование. 1. Цилиндрической формы бюксы диаметром 2.5 см (несколько десятков). 2. Черные фотографические кюветы. 3. Пипетки, калиброванные на 2 мл с выдуванием. 4. Центрифуга 2.500-3000 об/мин. 5. Термостат. 6. Торсионные весы. 7. Ступки.
Ход определения. Готовят йодную вытяжку фекалий (1:10) путем растирания их в ступке с кварцевым песком или измельченным стеклом при постепенном добавлении воды. Спустя 30 мин. осадок отделяют центрифугированием; если вытяжка имеет кислую реакцию на лакмус, ее нейтрализуют добавлением аммиака и затем разводят водой вдвое (разведение материала 1:20). Если ожидают высокое содержание энтерокиназы. Разводят еще в 10 раз (1;200), иногда даже в 100 раз (1:1000). В 7-10 бюксах готовят ряд геометрически возрастающих разведений так, что количество исследуемого материала убивает на 1/3 в каждом последующем сосуде по сравнению с предыдущим. Для этого во все бюксы, кроме первого, наливают по 1 мл дистиллированной воды, в первый наливают 1 мл разведенной вытяжки. Путем двукратного набирания в пипетку и обратного выдувания вытяжку перемешивают с содержащейся во втором бюксе водой. Из второго бюкса 2 мл смеси переносят в третий, где таким же образом перемешивают, снова переносят в следующий бюкс и т. д. Из последнего бюкса 2 мл смеси отбрасывают. Во все бюксы прибавляют по 2 капли раствора фосфата рН 7,16 (реактив №3) и по 0.03 г препарата трипсиногена (реактив №1 ). Навески препарата по 0.03 г в нужном количестве подготовляют еще до начала определения. Удобно пользоваться для этого торсионными весами. После прибавления препарата, смеси взбалтывают и помещают для активирования в термостат на час при 37°С. После этого во все сосуды быстро прибавляют по 0.5 мл 0,7 н аммиачного буфера рН 8,9 (реактив №4) и по 2 мл 5% раствора казеина, содержащего кальций (реактив №5), взбалтывают, переставляют на нагретую в термостате подставку с темным дном и вновь инкубируют при 37°С в течение 10 мин, после чего регистрируют результат. При надлежащем предварительном разведении материала казеин в нескольких бюксах с большим содержанием энтерокиназы оказывается переваренным. а в других - створоженным, что легко различимо невооруженным глазом. Регистрируют последнюю переваренную порцию, содержание энтерокиназы в которой равно одной условно принятой единице. Отсюда простой расчет даст содержание этого фермента в 1 мл или 1 г первоначально взятого исследуемого материала: Е=Р/а , где а -количество разведенной вытяжки в последней переваренной порции; Р - предварительное разведение. Возможная ошибка таких определений равняется 1/6 - 1/4 находимого количества единиц.
Клиническое значение. В фекалиях здоровых взрослых людей содержится от следов до 20 ед/г энтерокиназы. Характер (до 10 дней) пищи мало влияет на содержание фермента, только после очень резкого изменения диеты на 2-3-й день оно может быть несколько повышено -50-60 ед/г. Концентрация энтерокиназы зависит главным образом от состояния функции толстых кишок и деятельности нормальной кишечной микрофлоры. При их нарушении находят 200 ед/г и более, а при острых кмшечных заболеваниях с диареей - до 2000-3000 ед/г. У детей первых 2 лет жизни в норме высокое содержание - энтерокиназы в фекалиях, в возрасте около года - 700-800 ед/г.
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОПРОГРАММЫ