Принципиальная схема получения лимонной кислоты.

С6Н12О6 (глюкоза)

↓

СН3СО (пируват)

↓ ↓

СН2-СО-S-КоА НООС-СН2-СО-СООН

(Ацетил - КоА) (Оксалацетат)

↓ ↓

СН2-СООН-СОНСООН-СН-СН2СООН

(Лимонная кислота)

Уксусная кислота имеет наибольшее значение среди органических кислот. Ее используют при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна, инсектициды. Микробиологический способ производства уксусной кислоты состоит в превращении этанола в уксусную кислоту при участии бактерий Acetobacter и Gluconobacter. Процесс идет в анаэробных условиях в режиме непрерывного культивирования продуцента.

Получение уксусной кислоты. Область применения: пищевая, медицинская, микробиологическая промышленность. Микробиологическим способе состоит в конверсии этанола при участии бактерий штаммов Acetobacter, Gluconobacter.

Процесс в анаэробных условиях, в непрерывном режиме, при температуре 28 градусов. Питательная среда: 6-12% С2Н5ОН, 1 % бактериального гидролизата, 0,05 % К2НРО4, 0,1 % гидрофосфата аммония, 0,05 % MgSO4. Выход кислоты составляет до 90 кг из 100 кг безводного спирта.

После отделения бактериальной биомассы раствор уксуса фильтруют, освобождая от окрашенных, взвешенных частиц. Затем подвергают пастеризации.

Для увеличения концентрации исходные растворы вымораживают до 20-30 %.

Для получения ледяной уксусной кислоты (98-99,8 %) проводят концентрирование путем перегонки.

СН3СН2ОН+О2 → СН3СООН+Н2О

В производстве витаминов и органических кислот микробный синтез имеет огромное значение. Особое значение ему уделяется при получение витаминов для кормовых добавок, а также некоторых специфичных для микроорганизмов витаминов. Биотехнологические процессы получения оргкислот постоянно совершенствуются.

Производство витаминов.

Витамины – незаменимые органические соединения различной химической природы, необходимые любому организму в малых концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются гетеротрофы, и лишь автотрофы способны синтезировать витамины, в частности растения. Многие микроорганизмы образуют редкие витамины, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основной для разработки технологий промышленного производства.

Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, B₁₂, β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Осталь­ные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Витамины (от латинского vita – жизнь) это группа низкомолекулярных органических веществ, различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний.

Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует в недостаточном количестве и поэтому должен получать их в готовом виде с пищей. Витамины обладают исключительно высокой биологической активностью и требуются организму в очень небольших количествах: от нескольких микрограммов до нескольких миллиграммов в день. Большинство витаминов являются коферментами или их предшественниками и участвуют в многочисленных ферментативных реакциях.

В природе источником витаминов являются растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение.

К водорастворимым витаминам относят: витамин С, витамины группы В (тиамин или витамин В₁, рибофлавин или витамин В₂ , витамины В₆, В₁₂), пантотеновую кислоту и биотин. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, E.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов — продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологи­ческим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов.

Витамины группы В Получение витамина В2 (рибофлавин).

Одна тонна моркови содержит один грамм В2, одна тонна печени содержит шесть грамм, гриб Eremothecium ashbyii продуцирует 25 кг.

В качестве посевного материала используют споры гриба, выращенного на пептоне (7-8 дней при t = 29-30ºС). После стерилизации жидкий посевной материал идет в ферментер (время – 3 суток при температуре 28-30ºС концентрация В2 = 1,4 мг/мл). После ферментера культуральную жидкость концентрируют в вакууме, сушат на распылительной сушилке и смешивают с наполнителем. При использовании рекомбинантного штамма можно синтезировать втрое больше продукта за 40 часов ферментации

Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂ флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ — розеофлавину. .

При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме: посев на скошенную агаризованную среду в пробирке на жидкую среду, в колбы с нарастающим объемом, в инокулятор.

В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят достаточно сложные органические вещества — соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфи­цированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях — ферментере и посевном аппарате.

Культивирование в ферментере ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28—30 °С, давление воздуха в ферментере (1—2) • 10⁴ Па, расход воздуха 1,5—2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мкг/мл.

Для получения кормового препарата рибофлавина культуральную жидкость упаривают под вакуумом до содержания 30—40% сухих веществ. Сироп высушивают в распылительной сушилке, сухую пленку дробят в дробилке до состояния порошка, который расфасовывают.

Очень важна хорошая обеспеченность флавинами кормов животных и птиц. Комбикорма должны содержать 5—6 г. рибофлавина на тонну. Добавки витамина В₂ в корма обеспечивают нормальный рост животных, высокую яйценоскость кур и выживаемость цыплят.

Витамин В₁₂ Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина B₁₂. Химический синтез корнестерона — структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

Витамин B₁₂ регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование предшественников гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т. п. Первоначально витамин B₁₂ получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез.

В природе витамин В₁₂ и родственные корринойдные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи мицелиальные грибы, корринойды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корринойдов широка распространена. Активно продуцируют витамин B₁₂ представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0-8,5 мг/л корринойдов, но получен мутант P. shermanii M-82, с помощью которого получают до 85мг/л витамина.

Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезирует Nokardia rugosa. Путем мутации и отбора получен штамм Nokardia rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В_!2.

Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. eshinospora, M. halophitica, M.fusca M. chalceae. Высокой кабаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus.

В нашей стране в качестве продуцента витамина В₁₂ используют Рropionobacterium freudenreichii var. shermaniil

Для получения витамина В₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфата аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения.

Бактерии плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар, крахмал), предотвращающих оседание бактерий, а также использование высокоанаэробных условий и автоматического поддержания рН позволяет получить наиболее высокий выход витамина — 58 мг/л. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90° С в течении 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25%-ной NaNO₂.

При получении Ко-В₁₂ стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до 6,8 - 7,0 50%-ным раствором NaOH. К нему добавляют A1₂(SO4)3*18H₂O и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс.

Очистку раствора проводят ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А1₂О₃. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом К0-В₁₂ может быть отделен от CN- оксикобаламина.

К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3 - 4° С 24 - 48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум - эксикаторе. Для предотвращения разложения Ко-В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете.

Для химической очистки витамина B₁₂ используется его способность образовывать аддукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделения витамина от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина В_]2 с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат.

В процессе получения витамина B₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред (замена глюкозы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс.

Витамин А и ß- каротин. Важное место в обмене веществ у животных занимает ß -каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Установлено, что многие микроорганизмы - фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание ß -каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ß -каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora — 38 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза р-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

Витамин А (ретинол). Основными источниками витамина А служат яйца, сливки, сметана, коровье молоко, сливочное масло, почки и печень крупного рогатого скота, печень некоторых рыб и морских животных: трески, палтуса, акулы, кита, тюленя и др. Суточная потребность человека в витамине А составляет 2,5 мг.

Витамин А в высших растениях и микроорганизмах не синтезируется, но у них образуется его предшественники - каротиноиды. Структурные изомеры каротина способны превращаться в организме человека и животных в витамин А в результате расщепления в печени и слизистой оболочке кишечника.

Каротиноиды — наиболее многочисленная и широко распространенная группа природных ферментов. Их образуют высшие растения, водоросли (хлорелла), бактерии. Кроме того, каротиноиды синтезируют некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Изомерные формы каротиноидов обладают различной А-витаминной активностью.

Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Химическим путем получают -каротин, витамин А и ряд других каротиноидов, синтез которых осуществляется в заводских масштабах.

Из растительных материалов каротиноиды могут быть выделены экстракцией органическими растворителями, не содержащими пероксидов, на рассеянном свету в инертной атмосфере с последующим омылением и хроматографическим разделением. Перед экстрагированием биомасса гомогенизируется при охлаждении. Процесс проводят в темноте в присутствии антиоксидантов. Для извлечения пигментов используют полярные растворители, например ацетон или метанол. Далее каротиноиды переводят в неполярные растворители, такие как гексан или петролейный эфир. Индивидуальные пигменты получают путем хроматографирования в тонком слое силикагеля или алюминия.Впервые каротиноиды были выделены из стручков перца, позже – из желтой репы и моркови Daucus carota, откуда и получили свое название.

Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Традиционными источниками получения каротиноидов служат морковь, тыква, шиповник, облепиха и др. Наряду с этим все шире в тех же целях используют мицелиальные грибы и дрожжи. Как продуценты каротиноидов представляют интерес бактерии и водоросли.

Перспективными в данном направлении являются некоторые фототрофные бактерии, у которых можно регулировать выход каротиноидов. Биомассу пурпурных бактерий, богатую каротиноидами в Японии используют в качестве добавок в рацион кур, что способствует более интенсивному окрашиванию желтка.

Продуцентами -каротина, широко применяемыми для промышленного получения этого пигмента, являются мукоровые грибы Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании разнополых штаммов этих грибов на специально подобранных средах выход каротина составляет около 3 – 4 г/л среды.

Среда содержит растительные масла, керосин, поверхностно-активные вещества и некоторые специальные стимуляторы. В последние годы в целях экономии для получения -каротина начали применять вторичные продукты отхода – кукурузный экстракт и гидрол. В качестве стимуляторов синтеза каротина используют цитрусовую пульпу и мелассу, а также циклогексан.

Процесс получения бета-каротина при использовании В. trispora многостадиен. На первом этапе выращивают отдельно положительные и отрицательные штаммы гриба. Следующий этап – совместное выращивание разнополых штаммов в ферментаторе при 26 ⁰С и достаточно интенсивной аэрации. На третьей стадии выращивания смешанную культуру вносят в большой ферментатор и инкубируют ее в течение 6-7 сут при той же температуре и аэрации. При использовании соответствующих стимуляторов можно как увеличивать выход продукта, так и изменять его состав.

Исследования получения каротиноидов продолжаются. На сегодняшний день показано, что удешевить процесс можно за счет использования отходов, остающихся при производстве целлюлозных материалов. Установлено, что синтез каротиноидов увеличивается почти в 7 раз, ели источником углерода в среде будет целлобиоза.

Каротиноиды широко применяются в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности. -Каротин используют главным образом в пищевой промышленности, а также при изготовлении лекарств и косметических средств.

Витамины группы D

Микробиологическим путем получают и эргостерин - исходный продукт жирорастворимого витамина D₂. В группу витаминов D объединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D₂ и D₃. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани. Недостаточное содержание витамина приводит к возникновению рахита. Суточная потребность человека в витаминах группы D составляет 0,025 мг/г.

Витамины группы D встречаются только в животном организме. В растениях содержатся стеролы, из которых под влиянием ультрафиолетового облучения образуются витамины этой группы. Наиболее важным из этих стеролов является эргостерол, содержащийся в большом количестве в дрожжах и пленевых грибах, используемых в качестве исходного продукта при промышленном получении витамина D_. Наиболее богатыми источниками витаминов группы D являются рыбий жир, печень млекопитающих и птиц. Витамины содержатся также в молоке (0,02-0,1 мкг/100 г), сливочном масле, в яичных желтках (от3,5 зимой до 12,3 мкг/100 г летом).

Источником эргостерина являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, но особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые и служат сырьем для его промышленного получения. Эргостерин – основной стерин дрожжей: содержание его составляет 0,2-0,5 %, но в некоторых случаях достигает 10 % от сухой массы дрожжей. Культурные расы дрожжей всегда богаче стеринами, чем дикие; наибольшее количество содержат пекарские и пивные дрожжи.

Из дрожжей наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis, биомасса которых может содержать более 10 % эргостерина. Эргостеролсинтезирующей способностью обладают дрожжи рода Rhodotorula glutinis (0,7-0,9 %), Candida utilis (0,4-0,6 %), C. tropicalis (0,2-0,3 % ). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов может достигать 1,2-1,4 % в расчете на сухой мицелий.

В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Saccharomyces carlsbergensis и Saccharomyces. Cerenisiae, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота. Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста дрожжей. В анаэробных условиях дрожжи содержат мало эргостерина и много сквалена.

Дрожжи, а также грибы рода Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D₂ или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи.

Для получения кристаллического витамина D₂ дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110 ⁰С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78 ⁰С и после охлаждения до 10-15 ⁰С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В. Витамин D₂ получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78 ⁰С трехкратным объемом спирта.

Спиртовые экстракты сгущают до 70 % содержания сухих веществ. Таким образом, получают липидный концентрат, который затем омыляют раствором едкого натра. Стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0 ⁰С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69 %-м спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют.

Источником получения эргостерина может служить мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты.