ВВЕДЕНИЕ

Согласно требованиям современности, врачами клинической лабораторной диагностики могут работать выпускники медицинских университетов, обучающихся по специальности Лечебное дело. Отсутствие учебного пособия для студентов по этой специальности создает определенные трудности обучения. В последнее время значительно увеличились объем и информативность объективных сведений о состоянии организма обследуемого пациента, которые лабораторная медицина может предоставить лечащему врачу. В пособии представлены сведения о некоторых основных современных направлениях и методах лабораторной диагностики. Наибольшее внимание уделено особенностям диагностики распространенных нозологий, диагностическим алгоритмам, построенным на рациональном и эффективном использовании тестов клинической лабораторной диагностики. Пособие соответствует рабочей программе по дисциплине «Лабораторная диагностика» по специальности Лечебное дело, иллюстрировано рисунками, таблицами и схемами, что позволяет лучше усвоить предлагаемый материал. Настоящее учебное пособие будет полезно также при подготовке студентов других специальностей, расширит их знания о диагностических возможностях современной лабораторной службы, диагностической значимости лабораторных технологий и лабораторных показателей.

4

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛИНИКИ И ЛАБОРАТОРИИ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА В ОРГАНИЗМЕ

Взаимодействие врача-клинициста и диагностической лаборатории при постановке диагноза в современном лечебном учреждении базируется на том, что клиницист определяет круг необходимых ему анализов, исходя из своего диагностического предположения и организует получение соответствующих биоматериалов пациента, а врач клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) предоставляет достоверную информацию о клеточном, биохимическом, молекулярном составе проб биологических материалов, полученных у больного, о соответствии показателей этого состава общепринятой «норме» и/или сопоставление их с раннее определявшимися у того же человека аналогичными показателями.

Клинические лабораторные исследования – это изучение состава образцов биоматериалов пациентов с целью обнаружения эндогенных или экзогенных компонентов, которые отражают состояния и деятельность органов, тканей, систем организма.

Клинические лабораторные исследования являются одним из главных направлений современной параклинической диагностики и выполняются по назначению врача с использованием специальных методов.

Единый процесс проведения лабораторных исследований общепринято делить на три этапа: преаналитический, аналитический (лабораторный анализ биоматериала) и постаналитический (интерпретация полученного результата). Правильность выполненного лабораторного анализа во многом зависит от

преаналитического этапа.

Преаналитический этап лабораторного исследования – комплекс мероприятий, выполняемых от момента назначения врачом пациенту определенного анализа до момента его проведения в лаборатории.

Основные составляющие преаналитического этапа

I.Преаналитическая фаза вне лаборатории:

•составление заявки на лабораторное исследование и оформление бланка направления;

•подготовка пациента, основанная на знании биологических ритмов, особенностей проведения исследований и клинической интерференции (влияния лекарственных препаратов на результаты лабораторных исследований);

•процедура взятия биологического материала для исследования;

•хранение биоматериала в процедурном кабинете или в отделении и его доставка в лабораторию.

5

Это важнейшая часть преаналитического этапа. Она полностью находится в компетенции врача-клинициста, но в еще большей степени в компетенции медицинской сестры.

II.Преаналитическая фаза в лаборатории:

•регистрация и маркировка доставленного в лабораторию биоматериала;

•пробоподготовка биоматериала к исследованиям (центрифугирование, термостатирование, аликвотирование, маркировка, доставка биоматериала на рабочие места).

Составление заявки на лабораторное исследование и оформление бланка направления

Каждая лаборатория должна разработать свою форму заявки на лабораторные исследования с учетом своих требований и возможностей. Не допускается указывать в бланке «биохимия крови». Обязательно проводить устное инструктирование пациента или выдачу ему памятки об особенностях назначенного исследования и правилах сбора биоматериала (моча, кал и т.д.), учет факторов (лекарственная терапия, пункции, массаж, цистоскопия, введения контрастных веществ и др.), влияющих на исследование.

Процедура взятия биологического материала для исследования

К первичным пробам биоматериала относят: кровь (капиллярная,

венозная, артериальная), мочу, кал, ликвор, мокроту, слюну, желчь, желудочное содержимое, выделения половых органов, выпотные жидкости, содержимое полостей, мазки-отпечатки, биопсийный материал.

К аналитическим пробам относят: сыворотку, плазму, осадок мочи,

выделенные ДНК, окрашенные мазки крови, нативные или окрашенные мазкиотпечатки.

Кровь. Основным видом биологического материала, который подвергают анализу в лаборатории, является кровь. Кровь состоит из клеток (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) и жидкой части, которая представляет собой раствор многих неорганических и органических веществ.

Обученный медицинский персонал осуществляет забор крови в комнате взятия биоматериала, находящейся вне лаборатории или в процедурном кабинете стационара, поликлиники. Продолжительность пережатия сосудов при наложении жгута (если это необходимо) должна быть минимальной и не превышать 1–2 мин. Пациенту не следует сжимать и разжимать пальцы рук, поскольку это вызывает местный стаз и гипоксию и, как следствие, сдвиги в распределении биохимических показателей.

Для различных видов исследования кровь необходимо собирать в пробирки разной маркировки. Наиболее часто используют моноветты или вакутейнеры. Моноветт – вакуумный шприц-контейнер со специальными иглами предназначен для взятия венозной крови как шприцевым способом, так и вакуумным. Вакутейнер – одноразовое приспособление, предназначенное для взятия проб венозной крови, представляющее собой комплекс из стерильной

6

одноразовой иглы и пробирки (непосредственно вакутейнера). Пробирки изготавливаются из пластика (полиэтилентерефталат), силиконизированы и содержат внутри дозированный вакуум и различные реагенты для забираемой крови в зависимости от вида исследования.

Вакутейнеры различаются по ряду признаков:

•назначению (биохимическое исследование крови, гематологическое исследование, коагулограмма и т.д.);

•объему пробирки (наиболее распространенные объемы – 2,7; 4; 4,5 и 8 мл);

•цвету колпачка (определяется наполнитель-реагент, который содержится в вакутейнере, и наличие геля).

Верхний колпачок вакуумной пробирки закодирован цветом, который говорит о том, какой специфический наполнитель имеется в вакутейнере. В случае, когда у одного пациента кровь берется в несколько пробирок, необходимо соблюдать правильную последовательность их заполнения для предотвращения возможной перекрестной контаминации пробы реагентами из других пробирок.

Если в вакуумную пробирку (вакутейнер) с пробой крови добавлены антикоагулянты, кровь остается жидкой (не сворачивается), и получаемая после центрифугирования жидкая часть называется плазмой.

Антикоагулянты – это добавки, которые тормозят процесс свертывания крови, что обеспечивает отсутствие существенных изменений исследуемых компонентов перед аналитическим процессом. Свертывание крови предотвращается путем связывания ионов кальция (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), цитрат натрия) или торможением активности тромбина (гепарин, гирудин). Твердые или жидкие антикоагулянты, находящиеся в вакуумных пробирках должны быть смешаны с кровью немедленно после взятия проб крови.

Маркировка вакутейнеров для взятия крови (по цвету колпачка)

1.Красный. Так маркируют пробирку с активатором свертывания крови. Из этой пробирки получают аналитическую пробу – сыворотку крови. Сыворотка – это жидкая часть крови, лишенная фибриногена. Активатор сокращает время свертывания, не влияя на результаты исследования.

2.Желтый. Пробирки с желтой крышкой имеют активатор свертывания и разделительный гель, находящийся на дне. При обработке в центрифуге формируется барьер, разделяющий сыворотку и форменные элементы.

3.Голубой. Данный вид пробирки предназначен для анализа коагуляции. В емкости содержится раствор цитрата натрия.

4.Черный. Пробирки содержат буферный раствор цитрата натрия. Изделия предназначены для исследования скорости оседания эритроцитов.

5.Розовый. Изделия разработаны для определения группы крови и проведения перекрестной пробы для переливания. Продукцию выпускают с наполнителем или без.

7

6.Зеленый. Данный вид пробирки предназначен для иммунологических исследований. В емкости содержится раствор гепарина.

7.Серый. Пробирки используют для определения содержания глюкозы. В пробирке содержатся флуорид натрия и оксалат калия. Образцы сохраняются длительное время, благодаря антикоагулянту и стабилизатору глюкозы. Изначальное состояние биоматериала не изменяется.

8.Фиолетовый. Изделия используют для проведения гематологических исследований. ЭДТА калия блокирует свертывание и связывание ионов кальция. В результате концентрация клеточных и внеклеточных компонентов крови сохраняется.

Категорически запрещается забирать кровь шприцом и переливать в вакуумную систему для взятия крови в связи с опасностью возникновения гемолиза и активации факторов свертывания крови.

Вечером, накануне сдачи крови на анализ, нежелательно употреблять тяжелую, жареную и жирную пищу. Кровь сдают натощак. Между ужином и забором крови должно пройти не менее 8, но и не более 14 часов.

Не рекомендуется сдавать анализ крови, если принимаются лекарственные препараты, так как это может исказить результаты тестов. По возможности, рекомендуется отказаться от приема препаратов на некоторое время, достаточное для того, чтобы организм очистился (10–14 дней). Если необходимо сдать кровь для оценки эффективности пройденного лечения, то это нужно делать не ранее чем через 7–14 дней после последнего приема лекарственного препарата.

При подготовке к сдаче анализа крови категорически запрещено употреблять алкоголь, курить в течение часа до забора крови, потому что курение воздействует на секрецию биологически активных веществ.

Подготовка к анализу крови предполагает воздержание от сильных эмоциональных и физических нагрузок, чтобы избежать биохимических и гормональных перестроек и, как следствие, искажения результата анализа.

Нельзя сдавать кровь после инструментального обследования, физиотерапевтических или других медицинских процедур, т.к. они могут вызвать изменение некоторых лабораторных параметров.

Перед взятием крови рекомендуется успокоиться и отдохнуть, например, посидеть в коридоре лаборатории 10–15 минут.

Кровь для общего анализа берут в пробирку с К2 или К3 ЭДТА (фиолетовый колпачок) и заполняют точно до указанного объема. После взятия крови пробирку аккуратно переворачивают в горизонтальную плоскость и перемешивают 8–10 раз. Недостаточное перемешивание также может привести к агрегации тромбоцитов, образованию микросгустков или коагуляции.

Венозная кровь является лучшим биологическим материалом для лабораторных исследований, так как стандартизация процессов взятия, хранения, транспортировки крови позволяет добиться минимальной травматизации клеток, примеси других веществ. Стандартизация взятия капиллярной крови затруднительна.

8

Кровь из пальца (капиллярную) рекомендуется брать в случаях:

•ожогов, занимающих большую площадь поверхности тела пациента;

•наличия у пациента очень мелких вен, или, когда вены труднодоступны;

•выраженного ожирения пациента;

•установленной склонности к венозному тромбозу;

•у новорожденных.

Пункция артерии для взятия крови на лабораторные исследования

используется редко, в основном для исследования газов крови.

Моча. В зависимости от предполагаемого анализа в лабораторию должны быть доставлены разные порции мочи. Перед сбором мочи пациент должен провести туалет наружных половых органов. Не употреблять красящие пищевые продукты (свекла, морковь). Не собирать мочу во время менструации.

Для общего анализа мочи собирают всю мочу после ночного сна. Из катетера можно собирать только свежую мочу. Из длительно стоящего катетера мочу для исследования собирать НЕЛЬЗЯ. После изъятия катетера не рекомендуется собирать мочу в течение 10–14 дней.

Исследование суточной мочи

Для этого анализа необходимо исследовать небольшую порцию (100–150 мл) (часть суточной мочи), но обязательно необходимо знать весь объем мочи пациента за одни сутки. Для исследования пациент должен собрать всю мочу в течение одних суток (24 часов), находясь на обычном для него питьевом режиме (до 1,5–2 л жидкости в сутки). Утром пациент освобождает мочевой пузырь, затем в течение суток, включая утреннюю порцию следующего дня, собирает всю мочу в чистую широкогорлую емкость с плотно закрывающейся крышкой. Эта емкость должна иметь объем не менее 2 л и храниться во время сбора в прохладном, темном месте.

После истечения одних суток пациент измеряет все количество суточной мочи и записывает результат. Из общего объема нужно отлить 100–150 мл и доставить в лабораторию. При регистрации анализа в лаборатории обязательно нужно называть полный объем суточной мочи.

Анализ мочи по методу Нечипоренко

Для этого анализа в лабораторию доставляют среднюю порцию утреннего мочеиспускания. Поэтому весь объем утренней мочи условно делят на 3 части, средняя часть из которых, подлежит анализу.

Обратите внимание! Если утром собирают мочу для анализа по Нечипоренко, то сбор мочи на общеклинический анализ проводят в другой день!

Анализ мочи по методу Зимницкого

Для этого анализа собирают 8 порций мочи в течение одних суток. Исследование проводят при обычном питьевом режиме и питании больного, но количество употребляемой жидкости в сутки не должно превышать

1,0–1,5 литра.

9

Вначале для исследования готовят 8 чистых прозрачных емкостей. На каждом сосуде отмечают номер порции и время ее сбора (900, 1200, 1500 и т.д.). В 6 часов утра пациент опорожняет мочевой пузырь, и эта порция не учитывается. Начиная с 9 часов утра, точно каждые 3 часа, собирают порцию мочи в отдельную маркированную емкость (до 6 часов утра следующего дня получится 8 порций). Для этого исследования все порции доставляют в лабораторию, где измеряют количество и относительную плотность каждой порции.

Кал. Материал для исследования должен быть собран в чистый, сухой контейнер. Следует избегать примеси к калу мочи, выделений из половых органов. Следует соблюдать диету, предписанную лечащим врачом, воздержаться от приема лекарственных препаратов, влияющих на секреторные процессы в желудке, на перистальтику желудка и кишечника, а также меняющих его цвет (препараты железа, активированный уголь и т.д.). Перед исследованием кала на скрытую кровь, должны быть отменены лекарственные вещества, содержащие металлы (бромиды, иодиды, медь, аскорбиновая кислота, ацетилсалициловая кислота,нестероидные противовоспалительные препараты).

Исследование кала проводят не ранее, чем через 2 дня после рентгенологического исследования желудка и кишечника.

Для исследования на простейшие (вегетативные формы) кал должен быть свежевыделенным. Проводят данное исследование в течение 15–20 минут после дефекации.

Ликвор. Ликвор собирают как минимум в 2 стерильные пробирки: 1-я – для общеклинического и биохимического анализа, 2-я – для бактериоскопического (фибриновая пленка) исследования.

Мокрота. Материал получают с помощью отхаркивания в специальном помещении. Перед тем, как выделить мокроту, необходимо прополоскать рот и глотку кипяченой водой. Ограничений в диете и приеме лекарственных препаратов нет. Если мокрота выделяется плохо, следует дать отхаркивающее средство накануне сбора и утром, можно применить аэрозольную ингаляцию.

Выделения женских половых органов. Взятие выделений женских половых органов проводит врач-гинеколог. В течение 24 часов перед исследованием исключаются спринцевания и применение внутривагинальных терапевтических средств, половой контакт. Материал равномерно наносят на предметное стекло, мазки высушивают на воздухе и направляют в лабораторию с сопроводительным бланком.

При получении материала необходимо помнить, что нельзя брать его:

•ватным тампоном;

•во время менструации.

Выделения мужских половых органов. Материал для исследования секрета предстательной железы получают после массажа предстательной

10

железы, проводимого врачом в течение 3–4 минут. Секрет собирают в чистую сухую пробирку.

Перед сдачей эякулята необходимо половое воздержание в течение 3–5 суток. Биологический материал получают методом мастурбации, нельзя использовать эякулят из презерватива. Эякулят собирают в чистый контейнер и сразу же доставляют в лабораторию.

Молекулярно-биологические исследования. Соскобы клеток берут в пробирки с физиологическим раствором или в специально-предназначенные пробирки с транспортной средой (фабричные пробирки, содержащие консервант «ДНК-экспресс»). При взятии образцов используют специальный одноразовый пластиковый зонд типа Сervex-brush (Voba-brush), имеющий вид ёршика и обеспечивающий получение большого количества клеточного материала с исследуемого участка.

Исследования на выявление возбудителей бактериальных инфекций необходимо проводить не менее чем через 2 недели после последнего приема антибиотиков и/или антибактериальных препаратов.

Мочу (первые 20–40 мл) собирают после туалета наружных половых органов утром или после последнего мочеиспускания через 3–4 часа.

При сдаче биоматериала из урогенитального тракта рекомендуется воздержаться от мочеиспускания и половых контактов в течение 2 часов перед взятием пробы. У женщин материал берут перед менструацией или через 1–2 дня после ее окончания.

За 3 часа до сбора слюны запрещается чистить зубы, полоскать рот, употреблять пищу, жевать жвачку.

Мокроту собирают утром натощак до выполнения гигиенических процедур при глубоком откашливании в количестве не менее 0,5 мл в стерильный одноразовый контейнер.

Содержимое везикул, пустул, язв собирают стерильным зондом и переносят в пробирку с транспортной средой.

Мазки с задней стенки глотки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, нёбных дужек и задней стенки ротоглотки, не касаясь языка и нёба.

Соскоб с конъюнктивы глаза берут, вывернув нижнее веко, зондом собирают эпителиальные клетки с конъюнктивы. Собранный материал переносят в пробирку с транспортной средой.

Взятие крови проводят из локтевой вены в вакуумную систему с антикоагулянтом ЭДТА в соответствии с инструкцией производителя вакуумных систем. Взятый биологический материал сразу же доставляют в лабораторию.

Биохимический анализ крови сдают строго натощак. Определение биохимических показателей проводят в сыворотке крови. Для этого в пробирку с активатором сыворотки (красный колпачок) или без наполнителя (коричневый колпачок) набирают кровь пациента, которую затем центрифугируют либо оставляют для отстаивания. Отбирают прозрачную часть

11

крови, оставляя в пробирке образовавшийся сгусток. Подготовка к биохимическому анализу крови предполагает более жесткие ограничения в рационе питания и режиме дня.

Мочевина. За 1–2 дня до забора крови необходимо отказаться от употребления богатой белком пищи. Запрещены физические нагрузки накануне.

Липопротеины, холестерин. Сдавать кровь на эти показатели надо через 12–14 часов после последнего приема пищи. Если нет необходимости определить гиполипидемический эффект терапии лекарственными препаратами, то за две недели до анализа крови надо отменить препараты, понижающие уровень липидов.

Глюкоза. Перед забором крови запрещено не только принимать пищу и пить напитки, но даже жевать резинку и чистить зубы.

Коагулограмма. Определение показателей свертывающей системы крови проводят в плазме крови. Кровь забирают в пробирку, содержащую 3,2% или 3,8% раствор цитрата натрия (голубой колпачок), соотношение объемов крови и цитрата натрия – 9:1. Первые капли крови выпускают на ватный тампон, так как они могут содержать тканевой тромбопластин. Сразу после взятия образца пробирку с цитратом необходимо аккуратно перемешать не менее 5 раз для предотвращения образования микросгустков. В результате центрифугирования получают прозрачную часть крови (плазму) и осевшие форменные элементы крови.

Гормоны. Определение гормонов проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок). После взятия пробы крови в вакуумные пробирки с гелем, ее следует перемешать путем переворачивания 5–6 раз. Гель твердеет, и образуется барьер между форменными элементами крови и сывороткой. Устойчивый барьер образуется через 5 минут после окончания центрифугирования пробы. Отбирают прозрачную часть крови, оставляя в пробирке образовавшийся сгусток.

При исследовании на адренокортикотропный гормон (АКТГ), ренин/ангиотензин взятие крови рекомендуется производить с 7 до 9 утра. Референсные значения данных гормонов рассчитаны именно на это время. До забора крови больной должен находиться в покое (сидя или лежа) не менее 1 часа.

При исследовании на кортизол и альдостерон взятие крови необходимо провести до 10 утра.

Важно помнить, что секреция гонадотропинов осуществляется в импульсном режиме с частотой импульсов – 1 раз в 60–80 минут. Поэтому при однократном взятии крови всегда есть шанс попасть на минимум или максимум пика. Избежать данной ошибки преаналитического режима можно путем получения 2–3 образцов крови в течение часа, объединения сывороток и определения гормонов в едином образце.

12

За 24 часа до сдачи крови необходимо исключить алкоголь, курение, тепловые процедуры (баня, сауна), физические тренировки, введение радиоактивных и рентгенконтрастных веществ, половые контакты (в любом их проявлении).

Женщины должны обязательно указать текущий день менструального цикла или срок беременности.

Не менее чем за 2 недели до начала исследования необходимо отменить прием оральных контрацептивов и препаратов, влияющих на концентрацию половых гормонов – циметидина, фенотиазинов, резерпина, алкалоидов спорыньи, диуретиков (особенно стероидных – верошпирона).

Фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны, эстрадиол должны исследоваться на 5–7-е сутки менструального цикла (МЦ).

Эстрадиол должен исследоваться в предовуляторные дни (11–13-е сутки

МЦ).

ФСГ, ЛГ и прогестерон должны исследоваться на 7-е сутки после предполагаемой овуляции – на 20–22-е сутки МЦ.

Если исследование проводят в период медикаментозного лечения, необходимо указать в направлении название лекарственного препарата и время последнего приема.

При исследовании функции щитовидной железы (ЩЖ) в период лечения препаратами, содержащими ее гормоны, исследование проводится через 24 часа после последнего приема препарата. За 2–3 дня до взятия крови необходимо исключить прием медикаментозных и пищевых препаратов, содержащих йод.

Онкомаркеры. Определение онкомаркеров проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок). При исследовании простатспецифического антигена (ПСА) за неделю до анализа необходимо исключить любые манипуляции с предстательной железой.

Раковые антигены (СА-15-3, СА-125). Данные онкомаркеры могут повышаться при наличии у пациента сопутствующих заболеваний общей патологии (хронические гепатиты, циррозы печени, доброкачественные фибромиомы, банальные гинекологические инфекции).

Раково-эмбриональный антиген (РЭА). Необходимо указать является ли пациент курильщиком, т.к. от этого зависит верхняя граница допустимого значения в норме.

Раковый антиген 19-9 (СА-19-9). Принято определять в сочетании с РЭА. Использование комбинации этих двух маркеров позволяет повысить степень выявления рака желудка до 70%, а рака кишечника – до 75%.

Аутоиммунные антитела, инфекционные антитела. Определение антител проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок).

13

Хранение и транспортировка биоматериала

Максимально допустимое время хранения проб – период времени, в

течение которого обеспечивается требуемая стабильность 95% проб биологического материала. Это минимальное требование, так как при наличии у пациента патологии стабильность аналитов в пробе может быть значительно снижена. Делают различие между хранением первичной пробы (кровь, моча, спинномозговая жидкость) и хранением аналитической пробы (плазма, сыворотка, осадок и т.д.). Хранение первичной пробы может быть только при комнатной температуре (от 20°С до 25°С), и она должна пройти пробоподготовку от 30 мин до 2 часов с момента получения. Хранение аналитической пробы при комнатной температуре (от 20°С до 25°С) допускается до 7–8 часов; при температуре холодильника (от 4°С до 8°С) – до 4 суток; при глубоком замораживании (-20°С) – до 6 месяцев.

Если биоматериал нужно транспортировать, то общим правилом должна быть доставка материала в лабораторию как можно быстрее. Для транспортировки биоматериала необходимо использовать специально предназначенные и промаркированные для этого термоконтейнеры отдельно для проб крови, мочи и другого биоматериала, а также бактериологических исследований. Термоконтейнеры должны обеспечивать соответствующие температурные режимы в зависимости от вида лабораторных исследований. Если для транспортировки в термоконтейнере необходимо поддерживать температуру 2–8ºС, то в них должны быть вложены хладагенты в нужном количестве. Для поддержания температуры при транспортировке в диапазоне 37ºС, термоконтейнеры необходимо оборудовать термоэлементами.

Перечень процедур по подготовке проб крови к транспортировке зависит от вида лабораторных исследований, используемых вакуумных пробирок, времени и условий транспортировки. Например, проба крови, взятая для исследования на АКТГ, ангиотензин I, II, ренин, альдостерон, гомоцистеин, кальцитонин, остеокальцин должна быть сразу после взятия помещена в лед и как можно скорее доставлена в лабораторию для центрифугирования.

Регистрация и маркировка биоматериала

Курьер (медицинская сестра или санитарка) доставляет контейнер с образцами биоматериала в комнату приема и взятия биоматериала и передает регистратору (фельдшеру-лаборанту).

В комнате приема фельдшер-лаборант открывает крышку контейнера и извлекает оттуда биоматериал и папку с направлениями на исследования. Согласно направлениям, делает запись в регистрационный журнал, сортирует и проверяет биоматериал на критерии для отказа в принятии лабораторией на исследования.

14

Критерии для отказа в принятии лабораторией биоматериала на исследования

1.Отсутствие маркировки на пробирке (фамилия, инициалы, отделение, номер палаты, дата взятия крови).

2.Несоответствие маркировки бланка – направления и используемой пробирки.

3.Неправильно заполненный бланк – направление (отсутствие сведений в некоторых графах).

4.Несвоевременная доставка материала для плановых исследований в лабораторию.

5.Несоблюдение сроков и условий хранения материала до момента доставки в лабораторию (замораживание, перегрев, утрата части материала при опрокидывании и т.д.).

6.Взятый биоматериал находится в несоответствующей пробирке, т.е. материал взят не с тем антикоагулянтом, консервантом и т.д.

7.Наличие сгустков в пробирках с антикоагулянтом.

8.Стекла предметные для цитологических исследований не имеют идеально ровную поверхность, высокую прозрачность, толщину до 1 мм.

Сотрудник лаборатории заносит информацию о причине отказа в выполнении исследования в журнал «Преаналитических ошибок», информирует об этом лечащего врача по телефону и фиксирует это в бланкенаправлении. Затем ставит штативы с пробирками (емкостями) для общеклинических, биохимических, иммунологических, коагулологических исследований в контейнеры с маркировкой «для переноса биоматериала» и относит их на обработку.

Обработка биоматериала

Приготовление проб из первичного образца включает все действия, требующиеся для того, чтобы сделать образец пригодным для анализа.

Например, приготовление плазмы или сыворотки, включает:

­центрифугирование;

­отбор аликвот;

­пипетирование;

­разведение;

­сортировку проб по сериям для автоматического анализа.

Перед проведением центрифугирования проверяют, все ли вакуумные пробирки, стаканы для них, вкладыши одинаковы по весу, форме и величине. Это делается для того, чтобы «плечи» ротора центрифуги были уравновешены. При выборе оптимальных условий центрифугирования необходимо ориентироваться на центробежную силу (g), а не на скорость вращения ротора (обороты в минуту). К паспорту центрифуги должна быть приложена таблица, указывающая связь между числом оборотов и величиной центробежной силы.

15

Факторы преаналитического этапа, влияющие на результат анализа

Существует множество факторов, влияющих на результат исследования. Прием пищи повышает содержание в крови глюкозы, холестерина, триглицеридов, свободных жирных кислот, аминокислот, неорганических фосфатов, калия, железа, т.е. веществ, содержащихся в пищевых продуктах, а также тех регуляторных соединений, которые вырабатываются в организме в ответ на включение пищевых компонентов в метаболизм метаболитов (инсулин, мочевая кислота) (рис. 1).

Рис. 1. Факторы преаналитического этапа, влияющие на результат анализа (Натрус Л.В. и др., 2012)

Характер изменений зависит от диеты (углеводная, жировая, белковая, бессолевая и т.д.). Так, богатая белком пища повышает содержание азота мочевины, фосфора, уратов примерно на 12 ч, а холестерина, гормона роста, инсулина, глюкагона – на 1–2 ч. Углеводная диета обладает менее выраженным влиянием на эти компоненты, за исключением инсулина.

У здоровых мужчин (22–30 лет), выкуривающих более 25 сигарет в день, повышается концентрация холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), содержание α2-макроглобулина. Снижается содержание липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и значительно снижается активность слюнного изофермента α-амилазы.

После употребления алкоголя в крови повышается активность ферментов печеночного происхождения. У больных хроническим алкоголизмом содержание в сыворотке крови общих липидов, ТГ, ХС, свободных жирных кислот выше, а фосфолипидов и эфиров ХС ниже, чем у лиц, не употребляющих алкоголь.

16

Важно помнить, что от корректно идентифицированных и стандартизированных образцов биоматериала зависят правильность выполнения лабораторных исследований и клинические решения врачей.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ

Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний относятся к прямым методам лабораторной диагностики. Основную группу этих методов составляют методы генетического анализа, к которым принадлежит ПЦР.

Этапы метода ПЦР:

•подготовка пациента и получение биологического материала;

•выделение нуклеиновых кислот (НК) возбудителя;

•амплификация;

•детекция (учет результатов).

Существует две основных группы методов выделения НК в зависимости от поставленных целей исследования методы: сорбционной экстракции и термической обработки.

Воснове методов сорбционной экстракции лежит лизис и денатурация компонентов биологического материала с помощью хаотропных агентов – высококонцентрированных растворов некоторых солей (например, гуанидин хлорида или гуанидин изоционата) с одновременной избирательной сорбцией НК на твердой фазе (частицах силикагеля, нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах). С помощью спиртовых отмывок ингибиторы удаляют, а НК впоследствии снимают с твердофазных носителей путем растворения их в воде или низкосолевом буфере. Данные методы очистки высокоэффективны, как в отношении дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), так и рибонуклеиновой кислоты (РНК). За счет высокой воспроизводимости результатов экстракции возможна количественная оценка содержания НК возбудителей в биологическом материале.

При использовании методов термической обработки биоматериала проводят нагревание и инкубацию в течение 5–15 минут образцов биологического материала при температуре 95–100ºС в присутствии детергентов. В результате этого происходит разрушение клеточных мембран, выход НК в раствор и инактивация (обратимая или частичная) ингибиторов. Так как ингибиторы не удаляются из раствора, а некоторые из них (в первую очередь РНКзы) устойчивы к нагреванию, этот метод не используют для очистки и экстракции РНК. Метод термической обработки относят к экспрессметодам, он прост в исполнении и позволяет за короткое время обработать большое количество образцов (рис. 2).

Всвязи с тем, что количество неинактивированных ингибиторов может значительно варьировать от образца к образцу, эффективность очистки ДНК такими методами трудно стандартизовать, поэтому их не рекомендуют

17

использовать в тех случаях, когда необходима количественная оценка содержания ДНК в биологическом материале.

Рис. 2. Схема выделения методом термической обработки (ресурсы сети Интернет)

Амплификация – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемое ДНК-полимеразой. Это увеличение основано на уникальном свойстве ДНК – удвоении.

В ПЦР процессы репликации ДНК осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C.

Этапы проведения амплификации

1.Расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация) происходит при нагревании раствора до 93–95°С.

2.Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой находятся в интервале от 50 до 65°С. Время отжига 20–60 сек.

3.Достраивание цепи дочерней нити ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения

праймеров.

Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70–72°С. Время

18

протекания синтеза – 20–40 сек. Остальные компоненты ПЦР: дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) в эквивалентных концентрациях 200–500 мкм; магний, необходимый для работы taq-полимеразы (2–3 мМ); трис-HCl-буфер рН 6,8–7,8.

Происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула, то за 30–40 циклов синтезируется 106–108 молекул ампликона, что делает возможным учет результатов.

Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов (рис. 3).

Рис. 3. Этапы амплификации (ресурсы сети Интернет)

Детекция продуктов амплификации

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы.

Детекция ПЦР при электрофоретическом способе (рис. 4)

осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле. В лунки агарозного геля, помещенного в камеру с буферным раствором и интеркалирующим красителем, вносится аликвота продукта ПЦР. Электроды камеры подключаются к источнику постоянного тока, в поле которого в геле

19

молекулы ДНК, заряженные отрицательно, движутся в направлении положительного электрода. Скорость движения зависит от длины фрагмента ДНК. Присутствующий в растворе интеркалирующий краситель связывается с двухцепочечной ДНК и флуоресцирует оранжевым цветом в УФ-свете. Наличие специфического продукта ПЦР в исследуемых образцах определяется по наличию флуоресцирующей полосы, расположенной в геле на одном уровне с продуктом амплификации положительного контрольного образца, содержащего либо нативный, либо рекомбинантный препарат ДНК выявляемого микроорганизма.

Рис. 4. Детекция методом электрофореза (ресурсы сети Интернет)

Наиболее современным способом учета реакции является регистрация флуоресцентного сигнала – «по конечной точке» (ПЦР-КТ) или в «режиме

реального времени» (ПЦР-РВ).

Технология ПЦР-РВ основывается на гибридизации флуоресцентных зондов с матрицей в процессе амплификации. Этот метод является количественным, так как уровень флуоресценции пропорционален количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.

Технология ПЦР-КТ подразумевает детекцию флуоресценции по окончании реакции, поэтому метод является не количественным, а качественным. Основная особенность данной технологии – детекция результата ПЦР в закрытой пробирке, быстрота детекции и, как следствие, упрощение и ускорение получения результатов ПЦР при одновременном уменьшении трудозатрат лаборатории. Для работы с этой технологией в лаборатории должен быть специализированный ПЦР-детектор флуоресценции «Джин» (рис. 5) или аналоги.

При проведении этапа амплификации НК из образцов биологического материала необходимо использовать контрольные образцы (КО):

•Внутренний КО – показатель прохождения реакции.

•Положительный КО – образец, содержащий либо фрагмент очищенной ДНК/РНК исследуемого возбудителя, либо рекомбинантный препарат с детектируемым фрагментом генома. Его назначение – определение наличия ДНК возбудителя путем сравнения.

•Отрицательный КО – образец, заведомо не содержащий НК искомого возбудителя. Назначение – контроль возможной контаминации.

20

Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Ограничения метода ПЦР

Амплифицируется ДНК, как живого, так и погибшего микроорганизма.

Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4–8 недель.

Возможность перекрестной реакции. Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме искомого и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, не был протестирован на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа.

Изменчивость микроорганизмов. Хотя при конструировании тест-

системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высококонсервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой.

Исследования методом ПЦР проводят на базе КДЛ, которая оборудована согласно требованиям, предъявляемым к данному типу лабораторий.

Интерпретация результатов ПЦР

Описанный метод открывает для врача клинициста довольно большие диагностические возможности, однако, часто врачи-клиницисты допускают ошибки на пре- или постаналитическом этапе данного исследования, что приводит к неправильным результатам и серьезно дискредитирует метод.

Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил сбора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего сбор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов.

Примеры ошибок, связанных с неверной диагностической стратегией врача:

22

1.Врач-клиницист не учитывает специфичность используемых тест-систем.

Больной с предполагаемым диагнозом «респираторный хламидиоз» направлен на исследование С. trachomatis в соскобе с задней стенки глотки. При постановке ПЦР использовалась видоспецифическая тест-система, выявляющая фрагмент генома С. trachomatis. Результат исследования отрицательный. Врач снимает предполагаемый диагноз «респираторный хламидиоз». Однако у больного инфекция может быть вызвана С. pneumonia, C. psitaci, которые не улавливаются данной тест-системой. Поэтому при назначении ПЦР-исследования больному врач должен четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

2. Врач не учитывает особенности персистенции и элиминации возбудителя. Больная с хроническим хламидийным цервицитом направлена на

контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии. Результат анализа положительный. Врач сделал вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение может быть ошибочным, так как погибшие и персистирующие хламидии дают положительный результат ПЦР-анализа. Окончательный вывод об излеченности можно сделать не ранее, чем через 5–6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для неоднократной смены эпителиального слоя, в клетках которого паразитируют хламидии.

3. Клиническая ошибка заключается в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР.

Зачастую отождествляются два принципиально различных понятия – «инфицированность» и «инфекционная болезнь». Известно, что только у 40–60% лиц с обнаруженным в крови цитомегаловирусом (методом ПЦР) заболевание может развиться клинически.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИЙ

Применение иммунологических методов с целью диагностики заболеваний органов и систем имеет в настоящее время большое значение. Наиболее широко иммунологические методы используют в области инфекционной патологии, аллергологии, эндокринологии, гематологии, в онкологии и при переливании крови, а также при изучении трансплантационного иммунитета и аутоиммунных заболеваний.

Иммунологические методы:

•детекция клеток и молекул иммунной системы с помощью маркированных моноклональных антител (МАТ);

•серологические исследования на основе взаимодействия антигенантитело;

23

•молекулярно-генетические методы (ПЦР, метод молекулярной гибридизации с использованием ДНК-, РНК-зондов, реакция секвенирования);

•культивирование клеток иммунной системы в лабораторных условиях.

Применение серологического метода на основе взаимодействия антиген-антитело для выявления различных антител

Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фаз. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза – более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями – образованием хлопьев (феномен агглютинации), преципитата в виде помутнения, окрашивания.

Реакции по регистрируемому эффекту и технике постановки:

•агглютинация;

•преципитация;

•нейтрализация;

•реакция с участием комплемента;

•реакция с использованием меченых антител и антигенов.

Реакция агглютинации (склеивание). Простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например, при добавлении изотонического раствора натрия хлорида. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка. Наиболее частое применение данной реакции – определение групп крови.

Группа крови – набор индивидуальный антигенных характеристик эритроцитов. По данным Международного общества переливания крови, у человека обнаружено 36 систем групп крови. Из них наибольшее значение в прикладной медицине имеют и определяются чаще всего системы AB0 и резусфактора. Но остальные системы групп крови также имеют значение, поскольку пренебрежение ими в некоторых случаях может привести к тяжелым последствиям и даже смертельному исходу. Систему групп крови АВ0 составляют два групповых эритроцитарных антигена – агглютиногены А и В, и два соответствующих антитела – агглютинины плазмы анти-А (α) и анти-В (β).

I (0) группа крови – агглютинины (αβ), агглютиногенов нет II (А) группа крови – агглютиноген А и агглютинин β

III (В) группа крови – агглютиноген В и агглютинин α

IV (АВ) группа крови – А и В, агглютиногены (АВ), агглютининов нет

Кроме системы АВ0 кровь различают по знаку резус-фактора. Резусфактор(Rh) – белок (антиген D) на мембране эритроцитов. Он присутствует не у всех людей. Есть антиген – резус-фактор положительный(Rh+), нет антигена

– отрицательный (Rh-) (рис. 6).

24