729

другом, а через гидрофобные и ионные взаимодействия – с фосфатными группами фосфолипидов и основными аминокислотами белков. Это обеспечивает большую подвижность липидов и ЛПС в мембране [38, 126].

Внутренний слой микробной клетки – пептидогликан (муреиновый или мукопептидный слой). Муреин, составляющий гликановый остов пептидогликана, представлен повторяющимися единицами N-ацетилглюкамина и N- ацетилмурановой кислоты, связанной Д-аланином. Его пептидная часть кроме Д-аланина содержит тетрапептиды, состоящие из L-аланина, D-изоглутаминовой кислоты, L- лизина или диаминопимелиновой кислоты. Кроме того, с помощью химического анализа установлено, что муреиновый слой энтеробактерий содержит липопротеидные молекулы. Цитоплазматическая мембрана состоит из гидрофобной зоны фосфолипидов, которую пронизывают белковые тяжи. Структурные белки мембраны встроены в двойной фосфолипидный слой. Остальные белковые компоненты соединяются гидрофобными связями либо с внешней, либо с внутренней стороной мембраны. Между пептидогликаном внешней мембраны и цитоплазматической мембраной располагается периплазматическое пространство, в котором аккумулируются периплазматические белки. Большая часть их представлена гидролазами (щелочная и кислая фосфатазы, фосфодиэстераза циклического аденозинмонофосфата, пенициллиназа и др.). Другую часть представляют белки, включенные в активный транспорт (связывающие белки). Часть из них расположена свободно (связывающие лейцин, аргинин, сульфат, галактозу), а часть соединена с внешней стороной цитоплазматической мембраны (белки, транспортирующие лактозу, пролин, фосфотрансферазу II) [38, 85].

81

На внутренней стороне мембраны синтезируются основные химические единицы муреина, липополисахарида, фосфолипиды, белки. Всего в цитоплазматической мембране обнаружено около 120 белков. На мембране фиксируются плазмиды – клеточные структуры, способные к автономной репликации без физического сцепления с бактериальной хромосомой. Цитоплазматическая мембрана ответственна за перенос электронов, активный транспорт химических соединений, синтез и перенос предшественников липидов, необходимых для построения клеточной стенки, синтез и перенос белков в периплазматическое пространство [17, 38].

При решении исследовательских задач данного раздела работали совместно со старшим научным сотрудником лаборатории структурной адаптации микроорганизмов ИФБМ РАН, к.б.н. Н. Е. Сузиной. Изучали особенности ультраструктурной организации модельных штаммов сальмонелл методом сравнительного электронно-микроско- пического анализа ультратонких срезов. Подготовительное препарирование образцов осуществляли следующим образом: клетки, выращенные на стандартной среде ЗПВ (контрольный вариант) и на сконструированной нами специализированной экспериментальной среде (опыт) центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Осадок клеток фиксировали в течение 1 часа при 4оС в 2,5 %-ном глутаровом альдегиде на 0,05М какодилатном буфере (рН 7,2). Затем биомассу трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 2 % растворе четырехокиси осмия в 0,05М какодилатном буфере (рН 7,2) в течение 2 часов при 20оС (или при комнатной температуре). После промывки в 0,05М какодилатном буфере (рН 7,2) осадок клеток заключали в 2 % агар, нарезали небольшими кубиками ~ 1 мм3 и осуществляли обезвоживание в серии спиртов возрастающей концентрации.

82

Затем, после пропитки в возрастающей концентрации смолы в абсолютном ацетоне материал заключали в эпоксидную смолу Эпон 812. Ультратонкие срезы получали на ультрото-

ме LKB-4800 (LKB-Produkter AB, STOCKHOLM-BROMMA

1, Швеция), монтировали на опорные сеточки, покрытые формваровой пленкой-подложкой, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу. Ультратонкие срезы просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-1200EX (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв.

На рисунке 11 представлено типичное строение бактериальной клетки сальмонелл, состоящей из жгутиков, клеточной оболочки и цитоплазмы.

Рис. 11. Ультраструктура Salmonella spp. (контроль) х25000. Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным (Условные обозначения: В – везикулы; Ж – жгутики; Н – нуклеоид; НМ – наружная мембрана; ППП – периплазматическое пространство; Р – рибосомы; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана)

83

Виден характерный извилистый профиль наружной мембраны, которая имеет 3-слойное строение и толщину около 20 нм. Далее следует периплазматическое пространство и 3-слойная цитоплазматическая мембрана. Цитоплазма клетки содержит нуклеоид и рибосомальный контент в классическом варианте. Имеются единичные везикулы, заполненные биологически активным веществом.

Длина сальмонелл, обогащенных в средах сравнения, варьировала от 1300 до 1500 нм, ширина от 500 до 600 нм

(рис. 12).

Рис. 12. Salmonella spp. (контроль) х25000.

Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным

Сальмонеллы, обогащенные в сконструированной среде, сохраняли характерное строение грамотрицательных бактерий, но в большинстве случаев были крупнее клеток кон-

84

троля. Их размеры находились в пределах 1500…2100 х 750…1000 нм (рис. 13).

Рис. 13. Salmonella spp. (опыт) х25000.

Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным

На рисунке 14 видно, что опытные образцы клеток Salmonella spp. секретировали большое количество неструктурированной слизи.

Рис. 14. Внеклеточная слизь. Salmonella spp. (опыт) х25000. Масштабная линейка 200 нм. Контрастирование рутениевым красным

85

В строении цитоплазмы также отмечена существенная разница между клетками опытных и контрольных образцов. В частности цитоплазма сальмонелл, обогащение которых происходило в разработанной среде, отличалась гетерогенностью с множеством электронно-плотных гранул (рис. 15).

Рис. 15. Строение Salmonella spp. (опыт) х25000. Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным

Одни из данных гранул имели геометрически правильную форму, другие имели морфологическое подобие внутриклеточных включений токсинов. Многие гранулы располагались на периферии цитоплазмы (рис. 16) и находились в тесном контакте с цитоплазматической мембраной (рис. 17).

Рис. 16. Внутрицитоплазматические гранулы Salmonella spp. (опыт). х25000. Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным

86

Рис. 17. Внутрицитоплазматические гранулы Salmonella spp. (опыт). х25000. Масштабная линейка 200 нм.

Контрастирование рутениевым красным

Кроме гранул иногда визуализировали внутрицитоплазматические мембранные образования, располагающиеся в основном на периферии цитоплазмы (рис. 18).

Рис. 18. Внутрицитоплазматические мембранные образования.

Salmonella spp. (опыт). х25000.

Масштабная линейка 500 нм. Контрастирование рутениевым красным

Таким образом, электронномикроскопический анализ сальмонелл, обогащенных в испытуемой и контрольных накопительных средах, показал наличие существенной разницы в строении цитоплазмы и величине клеток.

87

РАЗРАБОТКА УСКОРЕННОГО СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В МЯСЕ

И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СКОНСТРУИРОВАННОЙ НАКОПИТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Задачей дальнейших исследований стало определение наличия бактерий рода Salmonella в мясе, субпродуктах, в готовых мясных продуктах и полуфабрикатах путем использования сконструированной нами ранее питательной среды для накопления сальмонелл. Для решения данного вопроса было предложено провести лабораторные испытания мясной продукции, искусственно контаминированной сальмонеллами.

Впроцессе апробации сконструированной среды и разработанного способа выделения сальмонелл в «чистые» (свободные от сальмонелл) пробы пищевых продуктов вносили определенное количество Salmonella spp., формировали два образца, один из которых служил опытом, другой – контролем. Образцы проб хранили в условиях холодильника при температуре +2…+ 4°С.

Входе эксперимента было исследовано более 1000 образцов мясной продукции, свободной от БГКП, условно-

патогенных, патогенных микроорганизмов и микроорганизмов порчи, и содержащей КМАФАнМ не более 105 КОЕ/г.

Испытуемые образцы продукта массой 25 г контаминировали взвесью сальмонелл в количестве от 101 до 108 МТ/см3, гомогенизировали и исследовали как опытными, так и контрольным по ГОСТ 31659-2012 способами. Неселективное обогащение, идентификацию и типизацию контрольных образцов проводили согласно ГОСТ 31659-2012. Опытные образцы обогащали в сконструированной накопительной среде, проводили идентификацию и типизацию выделенных бактерий.

88

Учитывали чувствительность методов, скорость образования и количество типичных колоний на ВСА и XLD-агаре, изучали биохимические и серологические свойства выделенных сальмонелл, а также вели учет времени, затраченного на исследование (табл. 20).

Таблица 20

Результат выделения сальмонелл из мясной продукции опытным и контрольным способами

*S. Dublin, S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Infantis

**S. Choleraesius, S. Typhimurium

***S. Enteritidis, S. Infantis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Virhow, S. Hamburg

90