Лабораторна робота №2. Визначення ізоелектричної точки білків. Осадження білків
У водному середовищі розчинні білки мають певний заряд. Величина і знак заряду залежать від кількості іонізованих аміно- та карбоксильних груп амінокислот, що входять до складу даного білка.
Іонізація карбоксильних груп глутамінової та аспарагінової кислот надають білковій молекулі негативного заряду, а іонізація аміногруп лізину та аргініну – позитивного. Більшість білків мають негативний заряд, тобто є кислими білками.
За певного значення рН середовища ступінь дисоціації карбоксильних та аміногруп зрівнюється, і молекула білка стає електронейтральною. Значення рН середовища, при якому білок не несе сумарного заряду й не рухається в електричному полі, називається ізоелектричною точкою (ІЕТ).Для кислих білків значення ізоелектричної точки лежить в області рН менше 7,0, в якій пригнічується дисоціація карбоксильних груп:
Для лужних білків значення ізоелектричної точки лежить в області рН більше 7,0, в якій пригнічується дисоціація аміногруп:
Розчини білків в ізоелектричній точці нестійкі та легко випадають в осад.
Дослід1. Визначення ізоелектричної точки казеїну
Мета роботи: засвоєння поняття ізоелектричної точки білка та методики її визначення.
Завдання на виконання роботи: визначити ізоелектричну точку розчину казеїну.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: 0,1н розчин оцтової кислоти; 0,01н розчин оцтової кислоти; 0,5%-ий розчин казеїну в 1н розчині натрій оцтовокислого.
Принцип методу ґрунтується на створенні різних значень рН середовища і визначенні ізоелектричної точки у пробірці з найбільшим осадом казеїну.
Хід роботи
У вісім пробірок наливають по 1 мл розчину казеїну і додають у певних співвідношеннях розчини оцтової кислоти для утворення різної реакції середовища, згідно з табл. 1:
Пробірки витримують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Визначають ізоелектричну точку казеїну за максимальним ступенем помутніння.
Висновок: по таблиці максимальна ізоелектрична точка казеїну дорівнює 5,3, хоча максимальний ступінь помутніння ізоелектричної точки казеїну дорівнює 4,7.
Рекомендації: для визначення ізоелектричної точки білка можна використовувати різні методи, зокрема метод електрофорезу, метод гель-фільтрації, метод осадження білків різними реактивами тощо.
Дослід 2. Осадження білків солями важких металів
Мета роботи: засвоєння механізму осадження білків солями важких металів.
Завдання на виконання роботи: осадити білки розчинами солей важких металів з подальшим розчиненням утворюваного осаду білків надлишком цих солей.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки; скляні палички.
Матеріали та реактиви: 10%-ий розчин купрум сульфату; 5 – 10%-ий розчин плюмбум оцтовокислого; розчин білка (білок одного яйця розбавити дистильованою водою у 20 разів, перемішати і відфільтрувати через 2 – 3 шари марлі).
Принцип методу. Солі важких металів (міді, ртуті, цинку, срібла, свинцю) осаджують білки в результаті утворення нерозчинних у воді комплексних сполук із сульфгідрильними групами білків. Цю властивість білків використовують у медицині. Наприклад, білки молока, яєць використовують для рятування людей, при отруєннях солями ртуті, свинцю, міді тощо, як протиотруйний засіб.
Осад білка в надлишку солей деяких важких металів (плюмбум ацетату, купрум сульфату) розчиняється. Це пов'язано з тим, що надлишок іонів цих металів, адсорбуючись на поверхні білкових часток, викликає перезарядження білкового комплексу, в результаті чого він переходить у розчин. Це явище називається адсорбційною пептизацією.