- •Государственное образовательное учреждение
- •Введение
- •Тема 1: Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Тема 2: Структурная организация белковых молекул. Методы количественного определения белка.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Количественные методы определения белков
- •Лабораторная работа №2
- •Основные понятия фотоколориметрии
- •Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра
- •Тестовый контроль по теме « Строение белковой молекулы»
- •Тест 10
- •Тема 3 Физико-химические свойства растворов белков. Диализ. Осадочные реакции. Разделение смеси белков методом электрофореза.
- •2. Цель занятия:
- •3. Конкретные задачи:
- •5. Задание для самоподготовки:
- •Практическое применение осадочных реакций
- •Лабораторная работа № 3
- •Реактивы и оборудование
- •II.Диализ
- •III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов
- •Iy.Электрофорез
- •Осадочные пробы на белок
- •Тема 4: "Изучение свойств и биологической роли витаминов водорастворимой группы. Методы исследования свойств витаминов и количественного определения витамина с.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Лабораторная работа № 4 Количественное определение витамина с (аскорбиновой кислоты) в пищевых продуктах и в моче по методу Тильманса
- •Определение содержания витамина «с» в хвое и свежей капусте.
- •Определение содержания витамина «с» в сыром и вареном картофеле и в квашеной капусте.
- •Содержание витамина «с» в различных продуктах и моче
- •Тестовый контроль по теме « Витамины»
- •Установите строгое соответствие
- •3. Конкретные задачи.
- •4. Мотивация.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения.
- •Специфичность действия ферментов
- •Тема 6: "Активация и ингибирование ферментов.
- •3. Конкретные задачи.
- •Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.
- •Клиническое значение определения активности сывороточной хэ.
- •Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов
- •Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях
- •Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, к. Ф. 1.3.99.1) тетразолиевым методом
- •Определение общей активности лактатдегидрогеназы (к.Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов.
- •Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы.
- •Методы определения активности ферментов
- •Тест 15
- •Тема 7: "Энзимодиагностика и энзимотерапия. Клинико-диагностическое значение определения белкового спекра крови."
- •Тема 8 Программа контрольной работы по теме «Химия белков и ферментов. Витамины».
- •195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр.,д. 47
- •394019, Г. Воронеж, ул. Еремеева, 22ж
7. Этапы занятия и контроль их усвоения.
№ |
Этапы проведения занятия |
Форма проведения |
Время (мин) |
7.1 7.2
7.3.
7.4.
7.5
7.6. |
Постановка задачи. Контроль исходного уровня знаний. Разбор теоретического материала Разбор практических работ. Приобретение практических навыков. Обсуждение работы студентов. Подведение итогов занятия. |
Излагает преподаватель Тестовый контроль.
Опрос студентов по контрольным вопросам. Излагает преподаватель. Проведение практических работ и оформление протоколов. Ответы на вопросы студентов.
|
5 10
55
10 90
10 |
Пример билета проверочного контроля
Как влияет температура на скорость ферментативной реакции, приведите соответствующий график
Какой тип реакции катализируют ферменты класса трансфераз, приведите пример
Лабораторная работа №5
Влияние неспецифических факторов на активность ферментов. Специфичность действия ферментов.
Ферменты это биологически активные вещества белковой природы, выполняющие в организме роль катализаторов, которые:
а) не сдвигают равновесия реакции, а только ускоряют ее;
б) активны в малых количествах;
в) не входят в состав конечных продуктов реакции;
г) не вызывают новых реакций, а ускоряют реакции, возможные по термодинамическим условиям.
Но в отличие от неорганических катализаторов, ферменты:
а) работают в мягких условиях;
б) высоко специфичны;
в) обладают очень высокой каталитической активностью;
г) характеризуются высокой кооперативностью и запрограмированностью этапов действия;
д) термолабильны;
е) подвержены влиянию рН среды;
ж) изменяют свою активность под действием ингибиторов и активаторов .
Клинические и санитарно-гигиенические аспекты занятия
Ингибирование ферментов является ведущим звеном биохимического механизма патологических состояний, вызванных действием на организм токсических веществ и различных физических факторов (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, шум, вибрация и др.) внешней среды или как результат развития патологии при многих соматических и инфекционных заболеваниях. Поскольку все ферменты имеют белковую природу, их ингибирование может быть следствием конформационных и денатурационных изменений фермента, вызванных химическими или физическими фактором, и в этом смысле рассматривается как неспецифическое. Вместе с тем многие химические вещества обладают высоким сродством к активным центрам ферментов, блокируют их и вызывают специфическое ингибирование ферментов. Поэтому определение ферментативной активности крови, других тканей и жидкостей широко используется в лечебной и гигиенической практике с целью выявления признаков действия на организм вредных факторов среды, для изучения патогенеза заболеваний, оценки эффективности способов их профилактики и лечения. Например, в клинике определяют активность двух трансаминаз — аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ). Повышение активности АлАТ наблюдается при заболеваниях печени, а повышение активности АсАТ — при патологии сердечной мыщцы. Поэтому метод может быть широко использован при диагностике гепатитов, изучении действия гепатотропных ядов, для диагностики инфаркта миокарда.
Реактивы: 1. Сыворотка крови - источник фермента аланинаминотрансферазы 2. Субстратная смесь, содержащая аланин и a-кетоглутарат 3. Раствор гидроксида калия –10% (вещество, меняющее рН среды); 4. Раствор хлорида кадмия 1% (ионы тяжелого металла); 5. 2,4-динитрофенилгидразин - 0,5% раствор; 6. 0,4 Н раствор гидроксида натрия.
Принцип метода Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. Коферментом трансаминаз является фосфопиридоксаль, который служит непосредственным переносчиком аминогрупп. Определение концентрации кетокислот, образующихся в процессе трансаминирования из аминокислот, составляет основу методов количественного определения трансаминазной активности и проводится путем спектрофотометрических или фотоколориметрических измерений. Количество образующейся в данной реакции пировиноградной кислоты определяют по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в ходе которой развивается красно-бурое окрашивание в щелочной среде.
Аланинаминотрансфераза (К. .Ф. 2.6.1.2) катализирует реакцию переаминирования между L-аланином и а-кетоглутаровой кислотой:
Влияние неспецифических факторов на активность ферментов
Ход работы: в 4 пробирки наливают по 0,05 мл сыворотки крови, содержащей фермент аланинаминотрансферазу. В первую пробирку добавляют 0,5 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, во вторую добавляют 0,5 мл 10% раствора КОН, в третью – 0,5 мл 1 % СdСI2, в четвертую - 0,5 мл физиологического раствора эту пробирку используют для определения активности нативного фермента, в пятую - 0,5 мл воды, в эту пробирку сыворотку крови не добавляют, она служит контролем на реактивы. Через 5 мин во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора субстратной смеси и выдерживают их в термостате при 38°С 20 мин. После этого во все пробирки добавляют по 0,20 мл 2,4-динитрофенилгидразина, встряхивают и оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре, затем во все пробирки добавляют по 2,5 мл 0,4 Н гидроксида натрия, встряхивают и колориметрируют против пробы 5 в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм с зеленым светофильтром (l=560 нм) после 10 минут инкубации при комнатной температуре. Активность фермента определяют по калибровочному графику.
№
|
Сыво ротка крови 0,05мл |
Воздействие неспецифиче ких факторов |
Суб- стр. смесь 0,5мл |
Во да 0,5мл |
Физ р-р 0,5 мл |
Резуль - таты | ||
|
|
100С 10% 1% КОН СdCl2 0,5мл 0,5мл |
|
|
|
D
|
Активность | |
1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
| |
2 |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
| |
3 |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
| |
4 |
+ |
|
+ |
- |
+ |
|
| |
5 |
- |
|
+ |
+ |
- |
|
|
Вывод